尖吻蝮蛇毒PCA影响HUVEC分泌TF的机制研究

发布时间：2020-04-12 02:32

【摘要】：目的:探讨信号通路核转录因子-κB(NF-κB)、激活蛋白-1(AP-1)在蛇毒蛋白C激活剂(PCA)对人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)表达组织因子(TF)过程中的作用。方法:HUVEC体外常规培养,进行实验分组,分别是空白对照组、PCA组、LPS组和PCA+LPS组。DMEM完全培养基直接加入至空白对照组,浓度为1.25μg/ml的PCA溶液加入PCA组,LPS组加入0.1μg/ml LPS溶液,浓度为1.25μg/ml PCA和0.1μg/ml LPS的混合液加入到PCA+LPS组。培养12h后,直接在荧光倒置显微镜下观察内皮细胞形态,Hoechst33258检测PCA作用后细胞核的形态变化,MTT法检测HUVEC活力,免疫组化法检测TRAF6蛋白在细胞中的分布,免疫荧光染色检测核转录因子NF-κB是否被激活-核转运,Western blot检测细胞内NF-κB p65、FOS、JUN和TF蛋白的表达,qPCR测定TF的mRNA在HUVEC的表达,ELISA检测细胞培养上清中TF的含量。结果:1.PCA对细胞结构形态及生长增殖性的影响倒置显微镜直接观察细胞形态发现,对照组HUVEC为椭圆、多变或梭形,边界清楚,胞质饱满,呈铺路石状均匀贴壁生长。与对照组比较,LPS组细胞明显梭形化,形态不规则,体积缩小,但边界仍清楚,PCA组细胞形态无明显改变。正常组的HUVEC核在显微镜下呈均匀蓝色,边界清楚,色泽均匀。LPS组可见细胞核形态改变,缺如,呈片状浓染。而在PCA组与PCA+LPS组HUVEC核在显微镜下仍呈均匀蓝色,边界清楚,色泽清楚。MTT实验结果显示,LPS组与对照组相比细胞活力明显降低(P0.01),PCA+LPS组的细胞活力比LPS组微升(P0.05)。2.PCA(1.25μg/ml)能降低LPS引起的细胞内TRAF6蛋白表达免疫组化法检测TRAF6蛋白活化结果发现,对照组细胞呈多边或梭形,胞质内无明显黄染颗粒,细胞边界清晰。LPS组细胞胞质内出现明显的黄染颗粒,胞质染色加深,TRAF6平均光密度值升高,与对照组比较,可见TRAF6蛋白的表达量明显增加(P0.01)。而LPS+PCA实验组与LPS组比较,细胞形态正常,胞质黄染颗粒不明显,TRAF6平均光密度明显小于LPS组(P0.01)。3.PCA(1.25μg/ml)可影响LPS引起的细胞核内NF-κB被激活-核转运免疫荧光染色检测细胞核内转录因子NF-κB活化,结果显示,对照组HUVEC胞核内红色荧光较少,强度微弱。与对照组进行比较,在多数细胞中LPS组细胞胞核中红色荧光明显增多,荧光强度明显增强(P0.01),可见NF-κB明显被激活并转运至细胞核内;PCA组细胞与对照组相较,红色荧光强度较为微弱(P0.05)。与LPS组比较,LPS+PCA组细胞胞核内红色荧光明显减少,荧光强度也明显降低(P0.01),可见NF-κB的核转运明显受到了抑制。4.PCA(1.25μg/ml)降低LPS作用的HUVEC中NF-κB p65、JUN和FOS的蛋白表达Western Blot实验检测,结果提示,与对照组相比,LPS组NF-κB p65、JUN和FOS的光密度比值均明显增加(P0.01),而PCA组的比值无显著变化。PCA+LPS组3种蛋白的比值则明显低于LPS组(P0.01)。5.PCA(1.25μg/ml)降低LPS引起的内皮细胞内TF基因、蛋白及细胞上清中TF的表达通过qPCR实验检测发现,LPS组TF的基因表达量与对照组比较明显增多(P0.01);而与空白对照组相比,PCA组的基因表达无明显增加,差异无统计学意义(P0.05)。LPS+PCA组与LPS组比较,TF的mRNA表达明显减少,小于LPS组(P0.01)。TF蛋白检测结果,与对照组相比,LPS组TF蛋白的光密度比值明显增加(P0.01),而PCA组的比值无显著变化。PCA+LPS组蛋白的比值则明显低于LPS组(P0.01)。ELISA法检测细胞培养上清液中TF表达量的结果,与对照组相比,LPS组TF的表达量明显增加(P0.01),而PCA组的分泌量无显著变化。PCA+LPS组TF的分泌量则明显低于LPS组(P0.01)。结论:1、PCA对HUVEC结构形态及生长增殖性无明显作用,但是能够减轻LPS引起的VEC梭形化形态变化和细胞增长活性的变化;2、PCA可通过NF-κB、AP-1途径拮抗内毒素对HUVEC的损伤作用,并通过这种作用抑制TF基因的表达以减少TF的分泌,可能是PCA来防治血栓性疾病的机制之一。
【图文】：

细胞形态,梭形,细胞,细胞形态发生

皖南医学院硕士学位论文结果CA影响HUVEC形态结构和增殖活性的结果倒置显微镜下进行细胞形态的观察显微镜下直接观察药物作用后的细胞，，发现对照组 HUVEC 呈现的是梭形，细胞边界仍然清楚，胞质饱满，均匀呈铺路石状贴壁生长（如图照组比较，LPS 组细胞形态发生梭形化，体积缩小，细胞排列不规则楚（图 1B），PCA 组细胞形态无明显改变。与 LPS 组比较，PCA+LP态改变明显改善。

活力,对照组,细胞活力,细胞

图 2 PCA 对 HUVEC 核的影响（X200）A:对照组，B:LPS 组，C:PCA(1.25μg/ml)组，D:PCA+LPS 组T 法测细胞增殖活性结果增殖活力通过 MTT 法测定，由表 1、图 3 可见，LPS 组的细胞 O比较下降显著，细胞生长抑制率（IR）明显增高，可见细胞活力）；PCA 组的 OD 值与对照组比较无明显改变，差异没有统计学）。PCA+LPS 实验组与 LPS 组比较，细胞 OD 值大于 LPS 组，IR细胞增殖活力上升明显（P<0.05）。表 1 PCA 对 HUVEC 活力的影响 ( x±s. n=5)LPS（μg/ml）PCA（μg/ml）OD 值 ol — — 0.554 0.051
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】