大黄治疗慢性肾脏病的活性部位及其抗肾纤维化的作用机制研究

发布时间：2020-04-17 02:02

【摘要】：慢性肾脏病(Chronic kidney disease,CKD)是多种原因造成的慢性进行性肾实质损伤,肾纤维化是整个肾脏损伤过程的主要病理特征和根本病理改变。在CKD的临床治疗上,药用大黄已凸显出独特的作用,但其主要的活性部位及各部位抗肾纤维化的作用机制尚待进一步研究。代谢组学在疾病的临床诊断、病理机制探究、生物标示物鉴定及药物作用机制研究中有不可或缺的作用。因此,本研究欲结合药理学及代谢组学的研究方法,从分子生物学与生物化学角度共同阐释中药大黄治疗CKD的主要活性部位及其抗肾纤维化的作用机制。研究方法:将40只体重为200±10 g的雄性SD大鼠随机分为对照组(CTL)、CKD组和大黄石油醚(PE)、乙酸乙酯(EA)、正丁醇(BU)提取物给药组。后四组大鼠灌服200 mg/kg·d~(-1)的腺嘌呤(含1%体积的阿拉伯胶),CTL组灌服等体积的生理盐水。大黄PE、EA和BU提取物组大鼠给予腺嘌呤3 h后再分别灌服剂量为800 mg/kg·d~(-1)的PE提取物、200 mg/kg·d~(-1)的EA提取物和600 mg/kg·d~(-1)的BU提取物。分别于第3和6周末,收集各组大鼠尿液;于第6周末,取颈动脉血和肾组织。血清和尿液用于生化指标检测、代谢组学与脂质组学研究;肾组织用于代谢组学、病理学、免疫组织化学及蛋白印迹研究。研究结果:(1)生化指标检测:相比CTL组,CKD组血清中肌酐、尿素、甘油三酯、胆固醇、尿酸等含量显著增加。大黄PE、EA和BU提取物给药后,肌酐、尿素、甘油三酯、胆固醇和白细胞的含量显著地减少,肌酐清除率、红细胞和血球密度的含量显著地增加,表明大黄各提取物对肾功能均有显著的改善作用。(2)病理学研究:苏木精-伊红染色(Hematoxylin-eosin staining,HE)和糖原染色(Periodic acid-schiff stain,PAS)染色结果显示CKD组肾组织中肾小管管腔扩张和炎细胞浸润增加;Masson染色结果显示CKD组大鼠肾组织显示不同程度的纤维化。大黄PE、EA和BU提取物给药后,肾小管管腔扩张和肾间质纤维化明显减轻,炎细胞浸润减少。其中,大黄EA提取物给药组的效果最佳,BU提取物的效果次之。(3)免疫组织化学分析:相比CTL组,CKD组中α-SMA、Collagen I、Fibronectin和TGF-β/Smad信号通路中p-Smad2,Smad2,p-Smad3,Smad3与Smad4的表达显著的升高,而Smad7的表达显著的降低。大黄各提取物显著抑制这些蛋白的异常表达;其中,大黄EA及BU提取物的抑制效果最佳。(4)蛋白印迹分析:相比CTL组,CKD组中TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Collagen III、PAI-1、Vimentin、FSP1的表达显著地增加,E-cadherin的表达显著地减少。大黄PE、EA和BU提取物给药后可逆转E-cadherin的下调,显著降低TGF-β1、Fibronectin、α-SMA、Collagen I、Collagen III、PAI-1、Vimentin和FSP1的表达。(5)尿液代谢组学研究结果:从大鼠尿液中鉴定28个生物标示物,代谢途径分析发现代谢产物与氨基酸、肌酐、嘌呤及嘧啶代谢密切有关。大黄PE、EA和BU提取物给药后,N-乙酰半胱氨酸、(2S)-2-[[9-[(2S,3R,4S,5R)-3,4-二羟基-5-(羟基甲基)四氢呋喃-2-基]嘌呤-6-基]氨基]丁二酸、肌酐、脱氧腺苷、组胺、羟基丙酮酸和甲基胞嘧啶的含量显著地增加,色氨酸、甲基N-3-丁烯酰甘氨酸酯、3-甲基二氧基吲哚、吡哆醇、嘧啶和三甲胺的含量显著地降低。该结果表明大黄各提取物可显著地改善异常的氨基酸、肌酐、嘌呤及嘧啶代谢,从而进一步延缓肾纤维化。(6)血清代谢组学及血浆脂质组学研究结果:24个生物标示物进行鉴定分析发现14个生物标示物源于血清代谢组学研究的结果,10个生物标示物源于脂质组学研究的结果。代谢途径分析发现24个生物标示物与脂肪酸、烟酸、嘧啶和花生二烯酸代谢有关。大黄PE、EA和BU提取物给药后,5,6-丙酸乙酯、葡糖脑苷脂、甘油三酯(55:1)、D-葡萄糖和哌啶甲酸的含量显著地增加;甘油三酯(53:0)、甘油二酯(38:9)、神经酰三己糖苷、棕榈酸、组氨酸-谷氨酰胺和烟酰胺的含量显著减少,表明大黄各提取物对异常的脂肪酸代谢、烟酸、嘧啶和花生二烯酸代谢有明显的改善作用。(7)肾组织代谢组学研究结果:肾组织代谢组学研究鉴得21个生物标示物,代谢途径研究发现生物标示物与氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、三羧酸循环和烟酸代谢有关。大黄PE、EA和BU提取物给药后,微球蛋白(18:3)、溶血磷脂酰胆碱(18:1)、硬脂酸、棕榈酸和亚麻酸的含量显著地减少,十六烯二酸和犬尿酸的含量显著地增加。其中,EA提取物给药组亚牛磺酸的含量显著地减少。BU提取物给药组3-羟基丁酸、2-甲基呋喃、尿嘧啶和PE提取物给药组苯基丙酮酸及烟酰胺的含量显著地增加,十八碳烯酸和棕榈酸的含量显著地减少。该结果表明大黄各提取物对异常代谢的氨基酸、嘌呤、嘧啶、脂肪酸、三羧酸循环、烟酸代谢有很强的改善作用。结论:药理学及代谢组学研究发现大黄PE、EA和BU提取物是大黄治疗CKD的活性部位,三个活性部位均有改善肾功能和抗肾纤维化的作用。其作用机制可能与抑制TGF-β/Smad信号通路和改善氨基酸、肌酐、嘌呤、嘧啶、脂质与烟酸等在内的多种异常代谢有关。
【图文】：

用于蛋白印迹分析和灰度测定。2.4 实验结果2.4.1 大黄治疗 CKD 的 HE 染色结果如图 5 所示，，CKD 组肾小管管腔扩张、炎细胞浸润增加；相比 CKD 组，CKD+PE提取物给药组肾小管管腔扩张减轻，但炎细胞浸润未见减少；CKD+EA 提取物给药组炎细胞浸润显著减少，肾小管管腔扩张显著减轻；CKD+BU 提取物给药组，炎细胞浸润减少，肾小管管腔扩张减轻。

图 6 CTL 组、CKD 组及各给药组大鼠肾脏组织 Masson 染色分析（ 200）附注 2：**表示 CKD 组与 CTL 组比较 P < 0.01；#表示大黄提取物给药组与 CKD 组比较 P < 0.05，##表示大黄提取物给药组与 CKD 组比较 P < 0.01。2.4.3 大黄治疗 CKD 的 PAS 染色分析结果结果如图 7 所示，相比 CTL 组，CKD 组肾小管管腔显著扩张；大黄提取物给药后，肾小管管腔扩张均减轻。其中，大黄 EA 提取物给药组肾小管管腔扩张显著减轻，大黄BU 和 PE 提取物给药组的效果次之。
【学位授予单位】：西北大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2630316