雷公藤红素诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡及其机制研究

发布时间：2020-04-16 23:58

【摘要】：目的:雷公藤红素是中国传统中药雷公藤单体之一,在抗肿瘤领域有很好的应用前景,本研究以体外培养的人骨肉瘤HOS细胞为研究对象,雷公藤红素处理人骨肉瘤HOS细胞后,检测雷公藤红素能否诱导HOS细胞凋亡,并在内质网应激和线粒体损伤的角度探讨细胞信号转导和蛋白分子表达水平,探讨相关凋亡的机制及与内质网应激的关系和以PERK为干预靶点增强雷公藤红素诱导骨肉瘤凋亡的有效性,通过调节内质网应激水平增强雷公藤红素抗骨肉瘤效应为雷公藤红素应用于临床治疗提供新的研究思路。方法:用不同浓度(0、1.5、2.5、3.5和4.5 μmol/L)的雷公藤红素处理骨肉瘤HOS细胞24h后,采用CCK-8法检测细胞活性,确定最佳实验浓度。采用倒置相差显微镜观察雷公藤红素处理后HOS细胞形态的变化,经Hoechst33258染色后在相差显微镜下观察细胞凋亡的形态学改变,用Annexin V-PI法检测雷公藤红素处理HOS细胞后细胞凋亡率的改变。采用流式细胞术检测细胞内Ca2+浓度变化,采用蛋白质印迹法检测内质网应激性凋亡相关蛋白分子表达水平,明确内质网应激性凋亡相关通路是否参雷公藤红素诱导的骨肉瘤HOS细胞凋亡。同时,采用内质网应激诱导剂毒胡萝卜素(thapsigargin,TG)处理骨肉瘤HOS细胞后,蛋白质印迹法检测细胞内质网应激性凋亡相关蛋白表达水平,为雷公藤红素诱导的骨肉瘤HOS细胞发生内质网应激提供阳性对照。进一步采用蛋白质印迹法检测线粒体凋亡相关蛋白表达水平变化,明确线粒体凋亡相关通路是否参雷公藤红素诱导的骨肉瘤HOS细胞凋亡。采用内质网应激抑制剂(tauroursodeoxycholate,TUDCA)抑制细胞内质网应激水平,采用Annexin V-PI法检测HOS细胞凋亡水平的变化,蛋白质印迹法检测细胞内质网应激、自噬和凋亡相关分子蛋白的变化,明确雷公藤红素诱导的内质网应激对HOS细胞凋亡的影响。最后,使用PERK磷酸化抑制剂(GSK2656157)下调PERK的磷酸化程度,抑制内质网应激中PERK相关通路活性,采用Annexin V-PI法检测细胞凋亡水平,蛋白质印迹法检测细胞内质网应激、自噬和凋亡相关蛋白分子表达水平,明确抑制PERK相关通路活性是否可以促进雷公藤红素诱导的骨肉瘤HOS细胞凋亡。结果:不同浓度的雷公藤红素均可明显抑制骨肉瘤HOS细胞活性,且其抑制效果呈浓度依赖性。雷公藤红素可诱导骨肉瘤HOS细胞凋亡,同时激活内质网应激、内质网应激性凋亡相关通路和线粒体凋亡相关通路,主要表现为经雷公藤红素处理后漂浮、紊乱HOS细胞增多,凋亡率明显升高,细胞内质网肿胀、破碎,细胞内Ca2+浓度明显升高,内质网应激和内质网应激性凋亡相关通路蛋白表达水平明显升高,线粒体性凋亡相关通路蛋白表达水平也明显升高。预处理TUDCA能抑制HOS细胞内质网应激,促进细胞凋亡,表现为使用内质网应激抑制剂后,HOS细胞凋亡率明显升高,细胞凋亡相关蛋白分子表达水平也显著升高。PERK磷酸化抑制剂(GSK2656157)可抑制内质网应激中PERK相关通路的激活,继而抑制HOS细胞自噬,促进细胞凋亡,表现为使用PERK磷酸抑制剂预处理HOS细胞后,细胞内磷酸化PERK蛋白表达明显下调,细胞凋亡相关蛋白表达水平明显上调,细胞凋亡率明显升高。结论:雷公藤红素可诱导人骨肉瘤HOS细胞凋亡,其作用机制可能与内质网应激介导细胞凋亡相关通路和线粒体凋亡相关通路有关。细胞内质网应激保护HOS细胞的同时也抑制细胞凋亡。PERK通路的激活介导了细胞自噬的发生。下调PERK通路的表达,可抑制HOS细胞自噬的活性,促进细胞凋亡。
【图文】：

２结果逡逑２．１雷公藤红素可明显降低骨肉瘤ＨＯＳ细胞的增殖活性逡逑ＣＣＫ－８法检测结果（图１）显示，不同浓度（１．５、２．５、３．５和４．５ｐｍｏｌ／Ｌ）的逡逑雷公藤红素能明显抑制人骨肉瘤ＨＯＳ细胞的增殖活性（各浓度组与ＤＭＳＯ组相比逡逑的尸值都小于０．０５），并呈一定的浓度依赖性（各浓度之间两两相比的Ｐ值皆小逡逑于０．０５）邋；邋ＤＭＳＯ组未出现细胞增殖抑制现象。计算得知，雷公藤红素处理ＨＯＳ逡逑细胞２４邋ｈ的ＩＣ５0为３．３邋ｐｍｏｌ／Ｌ。因此，选取３．０邋ｐｍｏｌ／Ｌ的雷公藤红素处理浓度用逡逑于后续实验［９］。逡逑１．５，逦Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑－ｍ－邋ＤＭＳＯ逡逑＾邋．逦＿逡逑＾邋１．０邋彳邋逦＊逦逦逦■逦■逡逑Ｉ－逡逑０．０－Ｉ逦１逦１逦１逦１逦１逡逑０逦１逦２逦３逦４逦５逡逑Ｃｅｌ（ｐＭ）逡逑图１邋ＣＣＫ－８法检测不同浓度的雷公藤红素处理２４邋ｈ对人骨肉瘤ＨＯＳ细胞增殖的抑制作用逡逑Ｆｉｇｕｒｅ．１邋Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ邋（０，，１．５，２．５，３．５邋ａｎｄ邋４．５邋ｆｉｍｏｌ／Ｌ）邋ｏｆ逡逑ｃｅｌａｓｔｒｏｌ邋ｏｎ邋ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｕｍａｎ邋ｏｓｔｅｏｓａｒｃｏｍａ邋ＨＯＳ邋ｃｅｌｌｓ邋ｆｏｒ邋２４邋ｈ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ＣＣＫ－８逡逑ｍｅｔｈｏｄ．邋ＤＭＳＯ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｔｒｅａｔ邋ＨＯＳ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｌｏｎｅ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ．邋＊Ｐ＜０．０５

逦重庆医科大学硕士研究生学位论文逦逡逑组相比，３．０邋ｔｕｎｏｌ／Ｌ雷公藤红素处理２４邋ｈ后人骨肉瘤ＨＯＳ细胞的凋亡率明显升高，逡逑提示雷公藤红素可以诱导ＨＯＳ细胞凋亡（ＰＣ０．０５，图２Ｃ，２Ｄ）。逡逑Ａ逦Ｃｏｎｔｒｏｌ逦Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ（２４邋ｈ）逦Ｂ邋Ｃｏｎｔｒｏｌ逦Ｃｅｌａｓｔｒｏｌ（２４邋ｈ）逡逑
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2630191