基于蛋白组学探讨加味五苓散对DNB大鼠的作用机制

发布时间：2020-04-17 02:59

【摘要】：目的:本课题在前期研究的基础上,复制糖尿病神经源性膀胱大鼠模型,运用高通量、高密度、高特异性的蛋白芯片技术,探讨加味五苓散干预糖尿病神经源性膀胱模型大鼠的可能作用机制,为研究中药复方的多途径、多靶点治疗特点提供可视化的思路。方法:1.分组与造模将55只体重160-180g的雌性SD大鼠检疫合格并适应性喂养1w后,测量其体重和血糖,无明显差异,将55只大鼠编号,按随机表法分为空白对照组(简称Control,n=8)、模型组(简称Model,n=15)、加味五苓散组(简称CHM,n=16)、氯贝胆碱组(简称WM,n=16),空白组继续普通喂养,其余各组大鼠改用高脂高糖饲养,8w后模型组、加味五苓散组、氯贝胆碱组大鼠腹腔注射STZ造糖尿病模型,空白组注射相应剂量的生理盐水,3d后测量血糖≥16.7mmol/L的为糖尿病造模成功,未成功或死亡的大鼠摒弃,其余三组大鼠继续以高脂高糖饲料喂养16w后进行尿动力学检测,确定糖尿病神经源性膀胱模型造模是否成功。2.药物干预根据动物公斤体重系数法算出加味五苓散组和氯贝胆碱组的给药剂量,空白组和模型组给予同体积的蒸馏水。四组给药方式均为灌胃,16w尿动力学检测完毕后进行,持续4w。3.取材与检测(1)定期对实验大鼠进行血糖、体重、尿量测量,比较组间和组内差异,观察动物的一般状态,辅助判断大鼠造模成功与否,药物干预前后进行尿动力学检测,确定大鼠造模成功与否及初步判断药物干预效果。(2)尿动力学检测完成后,进行取血,将膀胱组织固定在4%的多聚甲醛固定液中保存,酒精梯度脱水、二甲苯透明、石蜡包埋后,将膀胱组织蜡块切成约3-4μm的切片,进行HE染色。(3)血液室温下静置4h后离心取血清,采用RayBiotech试剂盒进行检测,用GSR-CAA-67蛋白芯片技术结合数据分析软件进行数据分析。(4)对大鼠血清蛋白芯片的结果进行Elisa验证分析。结果:1.造模:(1)一般状态:未经STZ腹腔注射造模的空白组大鼠精神饱满,反应灵敏,进食量、进水量与体重均稳步增长,毛色洁白有光泽,未见脱毛现象,眼睛明亮有神,大便质地较硬,尿量较少,无明显臭味。模型组、加味五苓散组、氯贝胆碱组大鼠精神较萎靡,糖尿病造模后开始阶段性情暴躁,同笼撕咬严重,后期则反应迟钝,多饮、多食、形体消瘦,毛色萎黄无光泽,且有片状脱毛现象,以颈部和脊背较严重,有三只大鼠眼睛出现视网膜病变,眼珠呈灰白色,大便溏泄且便量增多,尿液酸臭且浑浊,尿量多。(2)造模后模型组、中药组与西药组大鼠血糖升高,平均值均大于16.7mmol/L,提示糖尿病模型造模成功。(3)与空白组大鼠体重持续上升相比,模型组、加味五苓散组和氯贝胆碱组大鼠体重呈现先上升后下降趋势,与造模后糖尿病引起的消瘦有关。(4)尿动力学检测:四组的膀胱漏尿点压(BLPP)和最大排尿压(MVP)值,没有显著性差异,P0.05,与空白组相比,模型组、中药组与西药组尿动力学检测指标中的残余尿量(RV)增多、最大膀胱容量(VE)降低、排尿率(MBC)与膀胱顺应性增高,具有显著性差异,P0.05,模型组与中药组、西药组之间没有显著性差异,P0.05。2.加味五苓散对DNB大鼠的作用:(1)尿动力学检测:糖尿病病程16w,四组的BLPP和MVP相互之间没有显著性差异,P0.05,与空白对照组相比,模型组、加味五苓散组与氯贝胆碱组尿动力学检测指标中的RV增多、VE降低、MBC与膀胱顺应性增高,显著性差异P0.05或P0.01,模型组与加味五苓散组、氯贝胆碱组之间没有显著性差异,P0.05。说明在糖尿病病程16w时,DNB大鼠的膀胱已出现逼尿肌损伤、排尿异常,可能仍处于代偿期到失代偿期的过渡阶段,膀胱功能不稳定,膀胱漏尿点压和最大排尿压并无显著性差异,药物对其干预作用并不显著。(2)膀胱与肾脏病理学检测:膀胱病理学可见,空白组膀胱组织基本正常,模型组大鼠膀胱黏膜上皮细胞增生,固有层水肿,炎细胞浸润,中药组和西药组大鼠的膀胱炎症均减轻,且中药组效果比西药组好。肾脏组织病理学可见,中药对肾脏有一定的保护作用,可改善肾脏的炎症反应,缓解肾小管扩张,在一定程度上缓解糖尿病肾损害,比西药组改善效果好。3.蛋白芯片检测:(1)差异蛋白:空白对照组与模型组之间的差异蛋白有1个,即ICAM-1,空白组与中药组之间的差异蛋白有6个,即B7-1、Gas 1、IL-2 Ra、IL-22、Nope、Notch-2,与西药组之间的差异蛋白有7个,即ICAM-1、IL-1b、LIX、TCK-1、TIMP-1、Notch-1、Notch-2,中药组与模型组之间的差异蛋白有1个,即L-Selectin,西药组与模型组之间的差异蛋白有3个,即L-Selectin、PDGF-AA、Notch-2,中药组与西药组之间的差异蛋白有2个,即PDGF-AA、RANTES。(2)GO富集分析:中药组与西药组之间显著富集的GO term共有414种,与富集的GO term最相关的5种生物学功能有:a.对ERK1/2(细胞外调节激酶)的正调控作用。b.蛋白激酶B的信号调节。c.肌醇脂质介导的信号通路。d.磷脂酰肌醇介导的信号通路。e.磷脂酰肌醇-3激酶信号通路。空白组与模型组、中药组与模型组之间没有显著富集的GO。(3)KEGG富集分析:通过分析发现,中药组和西药组之间最为显著的是细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。4.Elisa验证:验证结果与蛋白芯片结果一致。结论:加味五苓散可有效改善DNB模型大鼠的膀胱功能,并对其肾脏有一定的保护作用,可能通过对其炎症机制的干预实现。
【学位授予单位】：广州中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2630370