基于THP-1细胞模型荆芥挥发油抗炎作用的NLRP3炎症小体调控机制研究

发布时间：2020-04-19 08:02

【摘要】：目的:以THP-1细胞为载体,观察荆芥挥发油及其主要成分胡薄荷酮抗炎作用的NLRP3炎症小体调控机制,进一步完善荆芥挥发油与模式识别受体相关的抗炎作用机制研究。方法:采用GC-MS法测定荆芥挥发油的化学成分,MTS法测定荆芥挥发油对细胞的毒性作用。利用佛波酯(PMA)将THP-1细胞诱导分化为巨噬细胞,然后采用LPS与激活物(ATP、Nigericin、CPPD或CaCl_2)进行造模,观察荆芥挥发油对NLRP3炎症小体激活的影响:(1)ELISA法检测细胞上清中IL-1β、IL-18、Caspase-1(p20)、Pro-IL-1β水平;(2)RT-PCR法检测细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的表达;(3)Western Blot法检测细胞裂解液中Pro-IL-1β、NLRP3、Pro-Caspase-1和ASC蛋白表达;(4)荧光探针法测定细胞ROS含量,免疫荧光法测定Cathepsin B、NLRP3和ASC蛋白表达。结果:(1)荆芥挥发油中胡薄荷酮的相对含量为33.40%,为其主要成分之一。(2)荆芥挥发油和胡薄荷酮在≤0.4mg/mL浓度时对THP-1巨噬细胞无毒。(3)0.2mg/mL浓度荆芥挥发油和胡薄荷酮均对ATP、Nigericin、CPPD和CaCl_24种激活物诱导的THP-1巨噬细胞上清中IL-1β的高分泌具有明显抑制作用(P0.05或P0.01),对ATP、Nigericin致细胞上清中Pro-IL-1β的分泌具有显著下调作用(P0.05或P0.01);0.2mg/m L荆芥挥发油亦对ATP、Nigericin致细胞上清中IL-18的分泌有显著降低作用(P0.05或P0.01)。(4)0.2mg/mL荆芥挥发油和胡薄荷酮对ATP诱导的THP-1巨噬细胞中NLRP3、Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的高表达有显著下调作用(P0.05或P0.01)。0.2mg/m L荆芥挥发油和胡薄荷酮对Nigericin致THP-1巨噬细胞中Caspase-1、IL-1β、IL-1α、IL-6 mRNA的表达具有下调作用(P0.05或P0.01),0.2mg/m L荆芥挥发油同时对NLRP3 mRNA的表达有降低作用(P0.05)。(5)0.2mg/m L荆芥挥发油和胡薄荷酮对Nigericin致THP-1巨噬细胞上清中Caspase-1(p20)蛋白表达有显著降低作用(P0.05或P0.01),0.2mg/m L胡薄荷酮对ATP致细胞上清中Caspase-1(p20)蛋白表达亦有显著降低作用(P0.05)。0.2mg/m L荆芥挥发油和胡薄荷酮对ATP致细胞裂解液中Pro-IL-1β蛋白表达均具有显著下调作用(P0.05)。(6)0.2mg/m L荆芥挥发油和胡薄荷酮能抑制ATP致THP-1巨噬细胞中NLRP3和ASC的共定位效应(P0.01),降低ATP、Nigericin致THP-1巨噬细胞中ROS的表达(P0.05或P0.01),并能减少CPPD致THP-1巨噬细胞中Cathepsin B蛋白的表达(P0.01)。结论:荆芥挥发油体外对各种激活物(ATP、Nigericin、CPPD或CaCl_2)所诱导的THP-1巨噬细胞上清中IL-1β的高分泌具有抑制作用,表现出抗炎效应,作用机制可能与抑制NLRP3炎症小体的激活有关,胡薄荷酮作用与其相似,可认为是其有效物质基础之一。研究结果进一步完善了解表药荆芥挥发油部位抗炎作用的现代药理研究,为其治疗“表证”的临床运用提供了药理学依据。
【图文】：

图 1 荆芥挥发油的 GC-MS 总离子流图表 1 荆芥挥发油 GC-MS 成分分析结果序号 化学成分名称 分子式 分子量 相对含量（%1 薄荷酮（I-Menthone） C10H18O 154 42.012 胡薄荷酮（Pulegone） C10H16O 152 33.403 棕榈酸（n-Hexadecoic acid） C16H32O2256 1.904 石竹烯（Caryophyllene） C15H24204 1.235 环己酮（Cyclohexanone） C6H10O 98 1.026 2-环己烯-1-酮（2-Cyclohexen-1-one） C6H8O 96 0.857 1-辛烯-3-醇（1-Octen-3-ol） C8H16O 128 0.828 8，9-去氢百里香酚（8,9-Dehydrothymol） C10H14O 150 0.789 薄荷醇（DL-menthol） C10H20O 156 0.6210 辣薄荷酮（(-)-trans-Isopiperitenol） C10H16O 152 0.5211 D－吉玛烯（Germacrene D） C15H24204 0.4412 D-柠檬烯（D-Limonene） C10H16136 0.35131－辛烯－3－醇乙酸酯C10H18O2170 0.27

图 3 THP-1 细胞经 5ng/mL PMA 诱导 48h 后细胞形态（20×）注：箭头所指为分化的典型的巨噬细胞2.3.2 NLRP3 炎症小体激活条件考察将处于对数生长期的 THP-1 细胞接种于 96 孔板中（每孔 2×104个细胞），经5ng/mL 的 PMA 诱导 48h 使其贴壁后，用 PBS 溶液清洗 3 次，除空白对照孔外其余各组再用 10μg/mL 的 LPS 刺激 3h，经 PBS 清洗 2 次后，分别加入不同浓度的激活物进行激活，各个激活物浓度及刺激时间如下：ATP（5mM）、Nigericin（5μM）刺激 1h，CPPD（40μg/mL）、CaCl2（5mM）刺激 6h。激活后收集细胞上清，采用 ELISA 法测定细胞上清中 IL-1β 的含量。结果表明，5mM 的 ATP、5μM 的 Nigericin 刺激 1h，40μg/mL 的 CPPD、5mM 的 CaCl2刺激 6h，均可显著升高细胞上清液中 IL-1β 的含量（P<0.01）。见图 4。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2633120