天然产物衍生物P-13抑制STAT3信号通路以及治疗肝损伤的机理研究

发布时间：2020-04-19 19:23

【摘要】：JAK/STAT信号通路调节细胞生长和分化等功能,在机体免疫应答和癌症发展中起到关键作用。寻找调节JAK/STAT信号通路转导的药物也是研究热点之一。中草药中含有的天然化合物,数目众多,结构各异。其中许多天然化合物被报道可以调节JAK/STAT信号通路,具有抗炎、抗肿瘤等活性,但是中草药及其含有的天然化合物起效的分子机制却未被完全揭示。因此,本论文的研究目的是从中草药化学成分里寻找可以调节JAK/STAT信号通路的化合物以及探究其作用方式,并且深入探讨中草药治疗人类疾病的可能分子机制。第一部分我们探讨了天然产物衍生物P-13抑制STAT3信号转导的机制。利用STAT3调节依赖的荧光素酶报告基因筛选平台,我们对中草药植物天明精中的一系列天然分子及其衍生物进行检测,最终获得一个活性很好的化合物P-13。P-13是天然分子PCL的衍生物,属于倍半萜内酯。我们发现,P-13以剂量和时间依赖的方式抑制IL-6诱导以及组成型的STAT3活化。体外激酶活性分析表明P-13直接抑制JAK2激酶活性。P-13同时也抑制IFN-α诱导的JAK1和TYK2的激活,表明它是一个泛JAK激酶抑制剂。P-13对IL-6/STAT3信号转导的抑制作用能够被还原剂二硫苏糖醇或谷胱甘肽阻断,这表明靶蛋白上的巯基和P-13中的α,β不饱和羰基间发生了反应。我们进一步用蛋白质谱分析技术以及计算机分子对接拟合方法,揭示了 P-13与JAK2的SH2结构域中的C452位点共价结合。我们还探究了 P-13对JAK/STAT信号通路具有一定选择性。此外,P-13在体外抑制许多肿瘤细胞系的生长并诱导其凋亡,比如乳腺癌细胞,结肠癌细胞等。特别是对那些表达组成型活化的STAT3的癌细胞系的生长抑制作用更明显。它还能够抑制裸鼠体内的人源结肠癌细胞异种移植瘤的生长。总之,我们的实验结果揭示了天然产物衍生物P-13是一个含有迈克尔受体(α,β不饱和羰基)的JAK2的新型共价抑制剂,并且是一个有希望的抗癌候选化合物。第二部分我们对中草药中普遍存在的、含有迈克尔受体(α,β不饱和羰基)的共价键化合物能否在半衰期较长的靶点蛋白上进行共价累积,从而治疗疾病的机制进行了探索。我们首先将8000多种天然植物,49种传统清热抗炎中草药植物以及21种经典抗炎中药方剂中含有的化合物,按照是否有α,β不饱和羰基结构进行分类。我们发现,含有该类结构的化合物约占所有天然植物中化合物的1/3;占清热抗炎中草药中化合物的1/5;占经典抗炎方剂中总化合物的1/4。几乎所有的方剂都含有该类化合物。说明共价键化合物在自然界以及在中药中普遍存在。我们利用炔基标记的含有α,β不饱和羰基的天然产物衍生物P-alk作为探针,通过CuAAC反应,来探究P-alk和不同蛋白的相互作用时间以及累积效应。在体外,我们发现,P-alk和蛋白的相互作用时间较短且差异较小。P-alk具有体积和重复给药累积效应。在体内,P-alk经过灌胃给药后,主要富集于肝脏中。在不同组织中,P-alk和蛋白间的相互作用时间不同。在肝脏中,虽然大部分蛋白和P-alk的相互作用时间较短,但是仍然有少数蛋白和P-alk的相互作用时间较长,例如和肝炎紧密相关的JAK2蛋白。我们发现P-alk能够剂量依赖地逆转ConA诱导的肝损伤。最后,我们以单次没有疗效的较低剂量P-alk进行重复给药,P-alk能够在肝脏JAK2蛋白上累积并逆转ConA诱导的肝损伤。因此,我们的研究结果揭示中草药中普遍含有α,β不饱和羰基的共价键化合物,能够在半衰期较长的靶点上,通过较低剂量重复给药进行累积。总之,我们的研究从分子水平揭示了中草药治疗人类疾病的一种新机制-共价累积。这项研究也给人们更好地开发利用中草药资源提供了新的理论指导。
【图文】：

7 个成员（STAT1, STAT2, STAT3, STAT4, STAT5a, STAT5b, STAT6 个保守结构域（图 1.2）10，并且每个结构域的功能各不相同。从次为：(1) N 端结构，它可以稳定 STAT 蛋白二聚体。(2) 卷曲螺旋调节 STAT 蛋白和别的蛋白之间相互作用。(3) DNA 结合结构域-binding domain, DBD），它直接调节 STAT 蛋白和 DNA 分子之间) 接头结构区，它用来连接 DNA 结合域和 SH2 结构域，但是它的还没有被完全揭示。(5) SH2 结构域，它对 STAT 蛋白和受体间的T 之间二聚化的形成非常重要。(6) 转录激活域（Transactivation d，，它主要调节 STAT 蛋白的转录活性。该结构域促进 STAT 蛋白和某间的相互作用，从而增强 STAT 蛋白的转录活性。STAT 蛋白未被单体形式存在；激活后，STAT 蛋白形成胡桃夹子状结构的二聚体核进行相关基因转录。因而，作为“胡桃夹子”铰链的高度保守的也成为目前大多数 STAT 抑制剂的主要靶向位置12。

一个 JAK 蛋白的 JH2 假激酶区直接结合其自身的 JH1 激抑制。在反式模型中，一个 JAK 蛋白的 JH2 假激酶区会白的 JH1 激酶区结合，互相抑制对方的激酶活性。在细由于受体的二聚化造成受体构象改变，从而导致连接在受离。最终使两个 JAK 蛋白的 JH1 激酶区互相靠近，互相 JAK 激酶进一步磷酸化相连受体上的酪氨酸位点，这些质中 STAT 蛋白的停靠位点，招募 STAT 蛋白16。STAT 蛋上磷酸酪氨酸位点相连之后，得以靠近 JAK 激酶，从而化其相应的酪氨酸位点而激活。磷酸化 STAT 蛋白通过 S细胞核进行相关基因的转录17, 18。在哺乳动物中，能被 细胞存活的因子如 B-细胞淋巴瘤 2（BCL-2）家族蛋白，周期蛋白 cyclin D 等。
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院上海药物研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2633651