南蛇藤素诱导内质网应激与自噬抗肝癌作用机制的研究

发布时间：2020-04-20 20:47

【摘要】：肝癌是世界范围内发病率处于前五位的常见恶性肿瘤。我国肝癌的发病率仅次于肺癌和胃癌,而死亡率仅低于肺癌。目前,治疗肝癌的首选手段为手术切除和肝移植。研究表明包括肝癌在内的恶性肿瘤细胞中存在着内质网应激。内质网应激及担负其应激信号传导任务的未折叠蛋白反应影响细胞的命运。南蛇藤素是自我国传统中药材南蛇藤根部分离得到的三萜类天然化合物。因南蛇藤素对NF-?B信号通路有抑制作用,其抗炎作用具有较高的研发潜力。近年的研究结果发现南蛇藤素亦具有潜在的抗肿瘤作用。本研究的目的是探讨南蛇藤素对肝癌抗肿瘤活性的分子机制。本研究通过体外实验观察不同剂量的南蛇藤素对两种人肝癌细胞Hep G2和Bel7402的抑制作用。利用CCK-8法、平板克隆集落形成实验、流式细胞术和western blot实验检测南蛇藤素对肝癌细胞增殖能力的影响。采用PI/AnnexinⅤ双标记法、TUNEL染色法和western blot实验观察南蛇藤素诱导肝癌细胞凋亡的情况。使用流式细胞术和western blot实验分别检测细胞内Ca2+浓度以及泛素化蛋白和参与蛋白合成的内质网分子伴侣表达,观察南蛇藤素诱导肝癌细胞内质网应激的情况。使用q PCR实验、western blot实验和CCK-8法观察南蛇藤素诱导未折叠蛋白反应的情况。应用生物电镜和western blot实验观察南蛇藤素诱导肝癌细胞自噬的情况,利用CCK-8法和western blot实验观察南蛇藤素诱导的自噬对肝癌细胞的作用。利用小鼠肝癌细胞H22的BALB/c小鼠荷瘤模型,观察南蛇藤素灌胃给药对荷瘤小鼠的疗效。研究结果显示,南蛇藤素可以抑制Hep G2和Bel7402的细胞活力及克隆形成能力。南蛇藤素可诱导Hep G2和Bel7402处于G2/M期细胞增多,南蛇藤素的这种细胞周期阻滞作用可能与其介导的两种细胞中,细胞周期相关蛋白p21表达增加和cyclin B1表达减少有关。南蛇藤素可诱导肝癌细胞发生细胞凋亡。南蛇藤素作用下Hep G2和Bel7402的凋亡相关蛋白caspase-3和PARP活化明显增强。两种内质网上的分子伴侣PDI和Ero1-L?蛋白表达下降提示南蛇藤素处理的肝癌细胞处于内质网应激状态。而南蛇藤素使两种肝癌细胞内的Ca2+浓度和泛素化蛋白表达量升高可能是南蛇藤素作用下,肝癌细胞内质网应激增强的压力信号。经南蛇藤素处理的肝癌细胞中,未折叠蛋白反应的关键蛋白el F2?和IRE1?的磷酸化水平升高,未折叠蛋白反应的相关蛋白Bip及其下游转录因子ATF4、CHOP和XBP1s的m RNA表达水平升高。联合使用内质网应激缓解剂TUDCA相比于单独使用南蛇藤素处理肝癌细胞,Hep G2和Bel7402的活力有所恢复,Hep G2细胞中的el F2?和IRE1?的磷酸化程度降低,ATF4和CHOP的m RNA表达水平有所降低,凋亡蛋白caspase-3和PARP的活化程度降低。生物电镜下观察经南蛇藤素处理的肝癌细胞,可见包含内容物的吞噬泡。南蛇藤素处理的肝癌细胞中LC3表达增强。使用自噬抑制剂3-MA与南蛇藤素共同处理肝癌细胞,相比于单独使用南蛇藤素,LC3表达减弱,Hep G2细胞活力降低和Bel7402细胞的活力增强。使用南蛇藤素灌胃治疗小鼠肝癌细胞H22的BALB/c小鼠荷瘤模型,使用5mg/kg剂量每日灌胃给药组小鼠的肿瘤体积明显小于溶剂对照组。溶剂对照组、2.5mg/kg剂量灌胃给药组和5mg/kg剂量灌胃给药组的小鼠体重变化无明显差异。药物治疗组小鼠与溶剂对照组小鼠血液中反映肝肾功能的指标无明显差异。免疫组化染色显示给药组小鼠相对于溶剂对照组,其肿瘤组织中活化的caspase-3表达量更高。结论:南蛇藤素可诱导肝癌细胞周期阻滞,抑制肝癌细胞的增殖。南蛇藤素作用下,肝癌细胞内钙离子稳态失衡和泛素化蛋白蓄积,以及内质网应激缓解剂TUDCA可降低南蛇藤素诱导肝癌细胞中凋亡标志蛋白的表达,提示南蛇藤素可诱导内质网应激相关细胞凋亡。南蛇藤素可诱导两种肝癌细胞的自噬,使用自噬抑制剂3-MA的结果提示南蛇藤素诱导的自噬在两种肝癌细胞中的作用有所不同。在小鼠肝癌细胞H22的BALB/c小鼠荷瘤模型中,南蛇藤素抑制小鼠肝癌生长。
【图文】：

图 1.2 南蛇藤素诱导细胞凋亡Figure 1.2 Celastrol induces apoptosis制蛋白酶体活性被视作一种蛋白酶体的抑制剂[67,68]。泛素-蛋质的重要路径。泛素-蛋白酶体途径主要包

Sapieha P. Cell Metab. 2015 Oct 6;22(4):560-75.图 1.3 未折叠蛋白反应Figure 1.3 Unfolded protein response当内质网应激时，Bip 与上述三个蛋白解离，结合内质网中未折叠或错误折叠蛋白发挥分子伴侣作用，帮助这些蛋白完成折叠或引导其降解。与 Bip 解离的
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：2634944