苦木生物碱的质量控制及其功效作用机制研究

发布时间：2020-04-20 22:38

【摘要】：苦木为苦木科植物苦木Picrasma quassioides(D.Don)Benn.的干燥枝和叶,是一种广泛分布于中国南方的落叶植物,具有清热、解毒、祛湿等疗效,为历版中国药典所收载。其中苦木生物碱(Picrasma quassioides alkaloids,PQAs)是主要的功效成分和质量控制的指标性成分。在现行质量标准2015版《中国药典》中仅对其性状、显微鉴别、薄层鉴别进行了规定,缺少对定性定量等关键内容的研究。文献研究中质量控制方法的适用性差,并且对功效作用机制研究不充分。本论文针对现行质量标准及文献研究的缺陷,对总碱含量测定、指纹图谱进行研究,并探索苦木生物碱的功效作用机制,为苦木的质量标准提高以及深入开发利用提供合理的科学依据。基于生物碱与改良碘化铋钾试液的络合沉淀反应,创新建立一种快速、简便的透射比浊定量分析方法,应用于苦木药材总生物碱含量测定。以苦木药材中丰度最高的生物碱成分苦木酮为对照,结合反应动力学研究,优化反应溶剂、介质酸度、反应时间等关键反应条件,确定在0.1 mol/L盐酸水溶液中反应5~20 min,于500 nm处测定吸光度值,外标法计算试样中总生物碱含量。方法学验证结果表明,所建立的方法具有良好的线性和准确度,线性方程为A=5.7654C-0.1444,相关系数(Correlation coefficient,r)为0.9984,平均回收率大于90.0%,相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)小于5.0%,表明透射比浊法满足定量分析的要求。该方法应用于20批不同产地批号的苦木药材总生物碱含量测定,平均含量为5.12 mg/g。为苦木药材质量标准的提升提供了可靠的依据。建立了以苦木酮为对照的苦木药材高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)指纹图谱,色谱条件采用Agilent 1100高效液相色谱仪,固定相选取的是Phenomenex Gemini C_(18)柱(250×4.6 mm,5μm);柱温为30℃;流动相为乙腈(A)-0.1%甲酸水体系,梯度洗脱程序为0~5 min 18%A→20%A,5~14 min20%A→28%A,14~16 min 28%A→35%A,16~40 min 35%A,流速1 mL/min,检测波长254 nm,进样量20μL,记录40 min色谱图。该方法缩短了分析时间,提高了系统稳定性和耐用性,改善了峰的分离情况。系统的方法学验证表明所建立的方法稳定可靠,适用于苦木药材的指纹图谱测定。依据12批样品图谱生成对照图谱,确定了19个共有峰,其中苦木酮为参比峰,为苦木药材质量控制提供了可靠的对照指纹图谱。12批样品的相似度均大于0.90,所形成的指纹图谱可有效的反映苦木药材的整体物质组成特征。利用液相色谱-质谱联用(Liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS),鉴定了18种可能存在的苦木生物碱成分,并将结果与指纹图谱关联,指认了其中17个峰的可能成分。通过网络药理学构建了苦木生物碱成分-靶点-通路网络,系统研究了苦木生物碱的作用机制。共预测了包括121个靶点和91条通路,排名位列前十的通路为介导癌症、炎症以及免疫相关的通路。最终筛选排名位列第一的色氨酸代谢通路,得到了该通路中介导癌症、炎症以及免疫相关的靶点吲哚胺-2,3-双加氧酶(Indoleamine-2,3-dioxygenase,IDO)。IDO是通过色氨酸途径进行癌症免疫治疗的重要靶点之一。通过计算机模拟和体外酶动力学评价,首次从苦木中的天然生物碱中发现具有潜在IDO抑制活性的化合物。基于分子对接分析表明,与IDO活性位点上亚铁离子配位对抑制效力有很大影响,氢键和疏水相互作用也显示出较大作用。构效关系(Structure-activity relationship,SAR)研究发现生物碱骨架类型对结合能及活性具有关键的影响,具有C-1羧基取代基的β-咔巴啉是这些生物碱的IDO抑制效力的关键药效团。酶促测定为1-甲酸-β-咔巴啉的有效性提供了进一步证据,1-甲酸-β-咔巴啉在这些苦木生物碱中显示为IDO中最有效的竞争性抑制剂,抑制常数(Inhibitory constant,K_i)和半抑制浓度(50%inhibiting concentration,IC_(50))分别为9.4μmol/L和32μmol/L。因此,这种天然色氨酸衍生的生物碱作为癌症免疫疗法有前景的IDO调节剂值得进一步深入研究。综上所述,本课题通过对苦木质量控制的关键内容总碱含量测定以及指纹图谱进行研究,为其质量控制提供了科学依据。并利用网络药理学探索了其功效作用机制,对该类功效成分的后续深入开发研究提供了基础。通过探索苦木生物碱对IDO的抑制作用及构效关系,为该类新型高效的IDO抑制剂的研发提供理论依据。
【学位授予单位】：烟台大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;R285

【参考文献】

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本文编号：2635040