乌头碱抗类风湿关节炎实验研究及其作用机制的探讨

发布时间：2020-04-21 00:26

【摘要】：目的:通过建立佐剂关节炎和胶原诱导关节炎动物模型,考察乌头碱对类风湿关节炎的治疗作用。以小鼠腹腔巨噬细胞RAW264.7为研究对象,考察乌头碱对RAW264.7细胞活力、细胞因子及相关蛋白的表达情况,以探讨其作用机制。方法:1.乌头碱对AA大鼠模型的治疗作用。Wistar大鼠50只,按随机数字表法分为正常组、模型组、甲氨蝶呤组、乌头碱低、高剂量组。除正常对照组外,各组大鼠右后足皮内注射弗式完全佐剂建立大鼠佐剂性关节炎模型。造模后第10天,乌头碱低、高剂量组分别灌胃0.025、0.050 mg/kg乌头碱,1次/d,甲氨蝶呤组灌胃0.5 mg/kg甲氨蝶呤,2次/周,连续给药19 d。末次给药后,使用足趾容积测量仪测量大鼠足肿胀度,按5级评分法计算大鼠关节炎指数,计算脾脏、胸腺指数,酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中白介素6(IL-6)、TNF-α水平,采用HE染色观察大鼠右足踝关节部位病理学改变。2.乌头碱对CIA大鼠模型的治疗作用。胶原诱导性关节炎(CIA)的大鼠模型的建立:除正常对照组外,各组大鼠尾根部注射0.2 mL 1 mg/mL二型胶原乳化剂,并在初次免疫7天后,在大鼠相同部位注射相同体积的胶原乳化剂加强免疫。在初次免疫14天后,将建模后大鼠随机分为5组,分别是正常对照组、模型组、甲氨蝶呤组、乌头碱低、高剂量组,并分别给予乌头碱(0.025、0.050 mg/kg)治疗后,并考察乌头碱抗CIA大鼠关节炎作用,包括关节炎指数(AI),足趾肿胀度,以及乌头碱对CIA大鼠免疫器官指数,血清中IL-6、TNF-α水平和CIA大鼠踝关节病理切片的影响。3.乌头碱抗炎作用机制。体外培养RAW264.7巨噬细胞系,分别以0,0.002,0.003,0.005,0.011,0.021,0.042,0.083,0.165,0.330 mg/mL乌头碱处理24 h,并设立正常对照组,采用MTT检测乌头碱对RAW264.7细胞活力的影响;设立正常对照组、脂多糖(LPS)组、LPS+乌头碱(0.083,0.165,0.330 mg/mL)组,ELISA检测细胞上清IL-6、TNF-α水平及Griess试剂检测NO含量,蛋白免疫印迹法(Western blot)检测胞核内核转录因子-κB p65(NF-κB p65)相关蛋白表达。结果:与正常对照组比较,AA/CIA模型组大鼠足肿胀度、AI、免疫器官指数、IL-6和TNF-α水平显著增高(P0.01,P0.05),AA模型组胸腺指数明显降低,乌头碱可明显减轻AA/CIA大鼠的足肿胀度(P0.01,P0.05),降低AA/CIA关节炎评分指数(P0.01,P0.05),降低两种RA大鼠脾脏指数(P0.01,P0.05)、CIA胸腺指数(P0.05)和升高AA胸腺指数(P0.05);降低RA大鼠血清中IL-6、TNF-α水平(P0.01,P0.05),但是对AA大鼠血清中TNF-α影响未见明显变化。此外,乌头碱能够明显改善AA/CIA大鼠踝关节病变情况,并能降低病理评分(P0.05,P0.01)。MTT结果显示,与正常对照组比较,乌头碱各浓度组细胞均能保持较好的活力,并没有明显的细胞毒性(P0.05),后续实验乌头碱浓度为0.083、0.165及0.330 mg/mL。ELISA结果显示,与正常对照组比较,LPS模型组IL-6、TNF-α含量明显高于正常组(P0.01),与LPS模型组相比,乌头碱各浓度组能够抑制IL-6、TNF-α的产生(P0.05,P0.01),Western blot结果显示,LPS能够上调RAW264.7细胞p-IκBα、核内NF-κB p65蛋白水平,而乌头碱能够抑制IκBα蛋白磷酸化,抑制NF-κB p65蛋白的入核。结论:乌头碱对AA/CIA大鼠具有一定的治疗作用,其作用机制可能是乌头碱能够抑制IKKβ、IκBα的磷酸化,从而抑制NF-κB信号通路活化。
【图文】：

碱对 AA 大鼠肿胀度的影响对照组比较，各组大鼠在造模 10 h 后足跖急速肿胀，18 h 左右达跖肿胀降低，，12 d 后足跖肿胀程度达到最低；在此期间，与正各组大鼠右侧足跖肿胀明显(P<0.01)；而除正常对照组外，各造跖肿胀度无统计学意义，表明造模成功。给药 7 d 后，乌头碱低跖肿胀度也有降低趋势。给药 19 d 后，与模型组比较，乌头碱肿胀度显著降低，具有显著的统计学意义(P<0.01)。乌头碱高剂所降低，但是不具有统计学意义(P>0.05)。如表 3-2。表 3-2AC 对 AA 大鼠肿胀度的影响( ±s,n=10)Table 3-2 Effect of paw volume in AA rats treated with AC( ±s,n=10)AA 大鼠肿胀度(μL)

照组相比##P<0.01；与模型组相比**P<0.01,*P<0.05。碱对 AA 大鼠 AI 的影响在接种弗氏完全佐剂致炎 6 d 后，造模大鼠关节红肿程度明显比，给药 9 d 后（致炎后第 18 天），乌头碱低剂量组可显著 AI(P<0.05)，给药 15 d 后（致炎后第 24 天），乌头碱低、高低关节炎大鼠的 AI(P<0.01，P<0.05)。甲氨蝶呤组给药 15 d 后）对大鼠 AI 也有显著降低作用(P<0.05)。如表 3-3。表 3-3AC 对 AA 大鼠关节评分指数的影响( ±s,n=10)Table 3-3 Effect of arthritis scores in AA rats treated with AC( ±s,n=10剂量（mg/kg）AA 大鼠 AI6 d 12 d 18 d 24 d
【学位授予单位】：贵州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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本文编号：2635139