基于调控肝星状细胞、肝癌细胞的相互作用探讨解毒方抗肝癌作用的机制

发布时间：2020-04-21 02:58

【摘要】：研究背景肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)是肝癌微环境中的主要构成细胞之一,也是肝纤维化发生的关键细胞。活化的HSC可以异常分泌一些细胞因子并通过激活ERK和NF-κB信号通路促进肝癌细胞的增殖和侵袭,微环境中的肝癌细胞又能够刺激活化的HSC表达血管内皮生长因子,促进肿瘤的形成。因此,抑制HSC的活化,有利于降低肝癌发生的风险,减缓肿瘤的发展及转移。导师凌昌全自拟的中药复方“解毒方”(Jiedu Fang,JDF),在临床研究和动物实验研究中均表现出良好的抗肝癌作用。然而既往的机制研究多局限于肝癌细胞本身。鉴于HSC活化在肝癌发生、发展中的重要作用,我们拟以HSC为立足点,观察解毒方是否能够通过影响HSC的增殖活化进而发挥抗肝癌的作用。研究目的1、解毒方对肝癌细胞增殖、迁移的抑制作用以及相关分子机制;2、解毒方对肝星状细胞增殖、活化的作用及分子机制;3、肝星状细胞和肝癌细胞之间的相互影响以及解毒方的作用。研究方法1、解毒方浸膏粉的制备由上海融禾医药科技发展有限公司加工,猫人参420 g、石见穿420 g、山慈菇168 g、鸡内金168 g,得浸膏粉30 g。将解毒方浸膏粉研成细粉后,200目滤网过滤。然后称取浸膏粉1 g,加入1 ml DMSO溶解,后加入15 ml无血清DMEM培养基充分溶解,3000 rpm离心15 min,用0.22μM滤器将上清过滤除菌,定容至20 ml,使药物终浓度为50 mg/ml。2 ml/管分装冻存于-20℃。2、解毒方对肝癌细胞增殖、迁移的影响采用MTT法、划痕实验及Transwell观察解毒方对人肝癌细胞SMMC-7721、HepG2及大鼠肝癌细胞RH-35增殖的作用。Western blot检测解毒方对肝癌细胞上皮间质转化的影响。3、解毒方对肝星状细胞增殖、活化的影响分离大鼠原代肝星状细胞,采用MTT法检测解毒方对人肝星状细胞LX-2及大鼠原代肝星状细胞增殖的影响;Western blot法观察解毒方对星状细胞α-SMA表达及MAPKs磷酸化的影响。4、肝癌细胞与肝星状细胞相互的影响及解毒方的作用(1)采用肝癌细胞smmc-7721条件培养基刺激肝星状细胞,并用不同浓度的解毒方进行干预,采用免疫荧光及westernblot观察解毒方对肝癌细胞促进肝星状细胞活化的影响;(2)采用解毒方干预肝星状细胞的活化,并获取条件培养基,利用肝星状细胞条件培养基处理肝癌细胞,通过划痕实验、transwell等方法观察肝星状细胞条件培养基对肝癌细胞迁移的影响及解毒方的作用。研究结果1、解毒方在体外能够抑制人肝癌细胞smmc-7721、hepg2及大鼠肝癌细胞rh-35的增殖,其作用具有时间和浓度依赖性;2、tgf-β能够显著的促进smmc-7721划痕的“愈合”,在12h时与对照组相比差异具有统计学意义(p0.01),而在24h时,虽然tgf-β组划痕小于对照组,但差异无统计学意义(p0.05)。而不同浓度的解毒方在两个时间点均能够显著抑制tgf-β诱导的smmc-7721细胞划痕的愈合(p0.01),提示解毒方在一定程度上能够抑制tgf-β诱导肝癌细胞迁移。tgf-β刺激能够显著增加肝癌细胞n-cadherin、mmp-2/9表达,而使用不同浓度的解毒方能够显著抑制tgf-β诱导的n-cadherin表达,降低mmp-2/9的表达水平,其作用具有剂量依赖性;3、解毒方在体外能够抑制人肝星状细胞lx-2、大鼠原代肝星状细胞的增殖,其作用具有时间和浓度依赖性;4、westernblot结果显示,tgf-β能够显著促进lx-2及大鼠原代肝星状细胞中α-sma的表达。而采用不同浓度的解毒方预处理,能够显著抑制tgf-β诱导的α-sma表达。tgf-β刺激能够显著上调lx-2细胞中erk,p38及jnk的磷酸化水平,而使用不同浓度的jdf预处理后,erk,p38及jnk的磷酸化水平显著低于单独使用tgf-β刺激组;5、免疫荧光及westernblot结果显示,肝癌细胞条件培养基能够显著增加大鼠原代肝星状细胞中α-sma的表达,而给予不同浓度的jdf预处理后,α-sma表达显著降低。划痕实验及transwell结果显示,活化的肝星状细胞条件培养基能够显著促进肝癌细胞迁移,而经过解毒方预处理的肝星状细胞条件培养基能够抑制肝癌细胞迁移,其作用显著高于未处理的肝星状细胞条件培养基,提示解毒方能够通过抑制肝星状细胞活化,进而抑制肝癌细胞的迁移;结论1、解毒方在体外能够抑制肝癌细胞的增殖、迁移;2、解毒方能够抑制肝星状细胞的增殖及活化,其作用可能与抑制MAPKs信号通路磷酸化有关;3、解毒方能够抑制肝癌细胞对肝星状细胞活化的作用;4、解毒方能够通过抑制肝星状细胞活化,进一步抑制肝癌细胞的迁移。
【图文】：

学位论文,细胞株

学位论文结果毒方对肝癌细胞增殖的影响毒方对肝癌细胞增殖的影响，我们首先采用 MTT 法MC-7721、HepG2 及大鼠肝癌细胞 RH-35 增殖的影响细胞株均具有一定的增殖抑制作用，其作用具有时

肝癌细胞,抑制作用,划痕,划痕实验

1×104/well in 100 μl of complete DMEM medium. After incubated for 24 h, the cells weretreated with indicated concentrations of JDF. After incubated for 24 or 48 h, MTT assaywas performed to determine the proliferation of cell. A, B, C, the effect of JDF onSMMC-7721, HepG2 and RH-35 cells proliferation, respectively. Each bare represents themeans ± S.D. (n=6). *p <0.05, * *p <0.01,vs control group.（二）解毒方对肝癌细胞迁移的影响然后，我们采用划痕实验和 Transwell 小室观察了解毒方对肝癌细胞迁移的影响。采用 ibidi 划痕实验插件，将 SMMC-7721 细胞铺于插件两侧，20,000/孔，24 h 后，取出插件，加入 TGF-β（10 ng/ml）及不同浓度的解毒方（JDF），在不同时间点进行拍照（图 2）。结果发现，TGF-β 能够显著的促进 SMMC-7721 划痕的“愈合”，在 12 h时与对照组差异具有统计学意义（P＜0.01），而在 24 h 时，虽然 TGF-β 组划痕小于对照组，，但差异无统计学意义（P＞0.05）。而不同浓度的解毒方组在两个时间点均能够显著抑制 TGF-β 诱导的 SMMC-7721 细胞划痕的愈合（P＜0.01），提示解毒方可能能够抑制 TGF-β 诱导肝癌细胞迁移。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】