基于Hedgehog信号通路的野黄芩苷抑制HT-29细胞源性结肠肿瘤干细胞分化的研究

发布时间：2020-04-24 02:13

【摘要】：目的:分别从体内和体外两个方面来考察半枝莲的主要成分野黄芩苷对结肠肿瘤干细胞(CSC)分化的影响,从Hedgehog信号通路阐明其作用机制,为野黄芩苷抗肿瘤作用的研究提供科学的实验基础。方法:(1)采用磁珠抗体标记法从HT-29人结肠腺癌上皮细胞中分选出结肠肿瘤干细胞(HT-29CSC),并对其进行无血清悬浮培养;(2)CCK-8法研究野黄芩苷对HT-29CSC体外活性的影响;(3)干细胞球形成法研究野黄芩苷对HT-29CSC体外自我更新的影响;(4)3D培养法研究野黄芩苷对HT-29CSC体外生长状态的影响;(5)软琼脂克隆法研究野黄芩苷对HT-29CSC体外生长转化的影响;(6)血清诱导分化试验研究野黄芩苷对HT-29CSC体外分化的影响;(7)q RT-PCR法研究野黄芩苷对Hedgehog信号通路基因Gli1、Ptch1,HT-29CSC标记物基因CD133、Lgr5,靶基因c-Myc、增殖基因Ki67、分化基因CK20和更新基因Nanog表达的影响;(8)Western Blot法研究野黄芩苷对HT-29CSC中c-Myc、Gli1、Lgr5蛋白表达的影响;(9)建立结肠癌裸鼠皮下移植瘤模型,采用腹腔注射方式进行给药,观察记录裸鼠体重和移植瘤的体积大小的变化,研究野黄芩苷对结肠癌HT-29CSC裸鼠移植瘤生长的影响;(10)q RT-PCR检测裸鼠移植瘤CD133、Lgr5、Gli1、Ptch1、c-Myc、Ki67、CK20、Nanog基因的表达;(11)Western Blot法检测裸鼠移植瘤c-Myc、Gli1、Lgr5蛋白的表达;(12)IHC法检测裸鼠移植瘤CD133、c-Myc、Ki67、Gli1蛋白的表达。结果:(1)流式结果显示,经磁珠分选后HT-29CSC中CD133的阳性表达率可高达99%;(2)野黄芩苷能够抑制HT-29CSC的体外活性,浓度越大,抑制作用越强。(3)野黄芩苷能够抑制HT-29CSC的体外成球能力,其中80μg/ml野黄芩苷、160μg/ml野黄芩苷成球率分别为(5.02±0.39)%、(1.53±0.35)%,显著低于溶剂对照组的成球率(12.20±0.32)%(P0.01);(4)野黄芩苷能够抑制3D培养HT-29CSC的生长,浓度越大,生长形态越差;(5)与溶剂对照组比较,野黄芩苷可以显著抑制HT-29CSC的体外生长转化(P0.01);(6)野黄芩苷能够抑制HT-29CSC的体外分化能力,浓度越大,分化能力越弱;(7)野黄芩苷能够下调HT-29CSC中Hedgehog信号通路基因Gli1、Ptch1,标记物基因CD133、Lgr5,靶基因c-Myc,增殖基因Ki67,分化基因CK20和更新基因Nanog的表达水平;(8)野黄芩苷能够降低HT-29CSC中c-Myc、Gli1、Lgr5蛋白的表达;(9)野黄芩苷对结肠癌裸鼠皮下移植瘤的生长具有抑制趋向;(10)野黄芩苷能够下调裸鼠移植瘤中CD133、Lgr5、Gli1、Ptch1、c-Myc、Ki67、CK20、Nanog基因的表达;(11)野黄芩苷能够降低裸鼠移植瘤中c-Myc、Gli1、Lgr5、CD133、Ki67蛋白的表达。结论:半枝莲的主要成分野黄芩苷能够抑制HT-29CSC分化,其作用机制在于抑制Hedgehog信号通路的活性。
【图文】：

芩苷抑制人结肠肿瘤干细胞体肠癌上皮细胞株 HT-29，人小肠上皮细芩苷（C21H18O12），分子量 462.36，，分司，进口分析纯，批号：73577。Hedg购自 Sigma-Aldrich 公司，批号：G9048装冻存于-20℃，临用前用细胞培养液稀

（二）磁珠分选、流式细胞仪检测①制备 MS 柱：将 MS 柱置于 MiniMACS 手动分选器中，小心向柱内uffer 进行润柱。注意加入 Buffer 时不能产生气泡否则会堵塞柱子。②上柱：待 MS 柱中的 Buffer 不再往下滴落时，将之前制备的 500至柱中，让其自然从柱中滴落。③洗柱：待加入的细胞悬液停止往下滴落后，小心加入 500μl Buff从柱中流出，待柱中不再有 Buffer 流出时，重新加入 500μl 的 Buffe过程需要重复操作三遍。④ 冲柱：待洗柱过程结束后，小心将 MS 柱移出分选器，然后放置集管中，加入 1ml Buffer 于 MS 柱中，再用配套的柱塞快速将液体⑤ 收集被推出的液体，上机检测。流式细胞仪检测结果显示，经免疫磁珠分选后得到的 HT-29CSC 中 达率可高达 99.0%，说明分选出的 HT-29CSC 纯度较好。
【学位授予单位】：成都中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

【参考文献】

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本文编号：2638408