中成药的DNA条形码鉴定：从mini-barcode到meta-barcode

发布时间：2020-04-24 05:24

【摘要】：中成药为我国人民群众常用药品,其质量安全为中医药事业发展的基础。目前根据《中国药典》规定,传统中成药的鉴别方式分为显微观察和化学检测。中成药品种类繁多,制作工艺复杂多样,传统的鉴定方法不能完全对药品成分定性分析,因此不法商家借机在药品中掺假造假,干扰市场秩序,危害消费者健康。本研究以三类中成药为例,从分子诊断角度出发,以DNA条形码为基础,通过DNA mini-barcode和meta-barcode对不同类型的中成药成分进行多方面分析和对比,探索多种分子检测方法,比较不同方法对中成药检测结果的利与弊,为建立适合中成药的分子诊断方法学提供了参考。研究具体内容和方法如下:1.改良中成药DNA提取方法,得到更高纯度DNA;2.基于基原物种条形码序列建立物种数据库,MEGA比对和筛选特异性片段和稳定遗传的SNP位点。通过设计特异性引物对短片段进行PCR扩增,得到DNA mini-barcode。通过下游的琼脂糖凝胶电泳,一代测序等方法对检测结果进行验证;3.结合一代分子克隆测序和二代高通量测序技术对多组分中成药进行DNA meta-barcode分析,利用生物信息学对二代测序结果展开精确到单碱基匹配的结果分析。研究结果如下:1.共收集76份金银花,山银花以及杜仲植物样品。基于杜仲单属单种特性在其ITS2序列开发出特异性的短序列分子身份证。基于金银花,山银花ITS2序列,分析找到了具有稳定遗传的SNP位点,并设计特异性引物扩增带有此SNP位点的DNA mini-barcode序列,通过SNP位点测序峰图粗判金银花/山银花掺伪比例。此方法可以用于对多组分金银花/山银花中成药中混伪品山银花和杜仲两种混伪品的单组分鉴定。对47份金银花中成药的鉴定结果表明,78%的药品中掺杂杜仲或山银花,证实DNA mini-barcode可以对金银花类产品进行有效分子鉴定。2.通过分子克隆和二代测序对中成药蛇胆川贝胶囊/散、川贝末胶囊中贝母成分进行鉴定。20份贝母中成药进行了分子克隆实验,并选取其中三份进行了二代测序,利用其高通量测序可获得大量ITS2的meta-barcode序列。在20份川贝母中成药中均检测出伊犁贝母、平贝母等非标签成分,仅2份含有川贝母。3.以人参健脾丸为例,结合二代测序和分子克隆对多植物组分中成药进行成分鉴定。建立了人参健脾丸药材饮片的对照模型,通过生物信息学对DNA meta-barcode数据进行精准深度分析。在人参健脾丸的阳性对照实验的数据分析中,该分析方法可以成功鉴定11味组方中的9种成分,并成功过滤掉冗余序列,保证测序结果准确性。本研究基于DNA条形码技术,从mini-barcode到meta-barcode对种类多样的中成药成分成功鉴定,提出了不同于传统鉴定的短片段分子诊断方法,该方法进一步拓宽了 DNA条形码在中成药鉴定中的应用范围,并使得鉴定结果更加精准。
【图文】：

的ＩＴＳ２序列的基础上开发出一段ＩＴＳ２序列中极具保守性的短序列（５邋１逡逑ＣＴＡＧＣＧＧＴＧＧＴＣＧＴＡＣＧＡＴＡＧＣＣＡＡＴＧＣＡＴＧＡＧＴ３邋’），长度为邋３４ｂｐ。根据邋ＢＬＡＳＴ逡逑结果（图２－１）可以看出序列覆盖度ｑｕｅｒｙ和相似度ｉｄｅｎｔ均为１００％。证明该序列为杜逡逑仲所独有，该序列在ＮＣＢＩ数据库或者ＢＯＬＤ数据中均可以成功区分杜仲和其他物逡逑种，因此成为杜仲分子身份证。本研究在分子身份证的基础上设计出可以扩增出该逡逑段序列的特异性引物ＤＺＦ１／Ｒ１，，扩增序列长度约为２１０邋ｂｐ。逡逑ｉｌ邋Ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ逦－逦＇逦：：：：：：逦＇逦一￣—＇＾逡逑Ｍａｘ邋Ｔｃｔｔｌ邋Ｑｕ？ｖ邋Ｅ邋＾邋ＡＫｅｓｓｉｃｎ邋：逡逑ｓｃｏｒｅ邋ｓｃｏｒｅ邋ｃｏｖｅｒ邋ｖａｌｕｅ逡逑ｒ＇邋＇■邋ｃｃＱｒ＇ＭＴｉｔ－逦＾逦６２邋６邋６２．６邋１００％邋７ｅ－０８邋１００％邋Ｋ￣６ｇ｜２Ｓ？Ｊ逡逑Ｃ．ｃｕｍｒｒ．0逦＾ｃ．－ｃ邋Ｒｉ－ｍ邋ｇｔ－＇．ｅ．邋＞ｉａ．Ｔ

ＩＴＳ２的扩增子长度为４２０邋ｂｐ。对金银花和山银花ＩＴＳ２序列进行分析后，可逡逑以在两个物种间发现稳定存在的２个ＳＮＰ位点。在金银花中两个位点对应的碱基逡逑分别为Ｇ和Ｃ，而４种山银花中则为Ａ和Ｔ邋（图２－３），ＳＮＰ位点所对应的位置分别逡逑在１６邋ｂｐ和６４邋ｂｐ。该ＳＮＰ位点分布稳定，在数据库中所有的金银花和山银花样品逡逑中均得到了验证。逡逑为了验证ＳＮＰ双峰法可以定量估计混合物中金银花和山银花所占比例，本实验逡逑将金银花和山银花粉末按照不同比例进行混合，比例分别为金银花－山银花：逡逑１５：１，４：１，１：４，１：１５，共四种混合物。对该四种混合物提取ＤＮＡ，利用通用引物２Ｆ／３Ｒ逡逑３３逡逑
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1

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本文编号：2638576