过载力诱导三维培养成骨细胞凋亡模型建立及野蔷薇苷保护作用研究

发布时间：2020-04-24 21:16

【摘要】：第一部分过载力诱导成骨细胞凋亡模型的建立目的:通过探究过载力持续时间及加载周期对成骨细胞凋亡的影响,建立应力性骨折的成骨细胞凋亡模型。方法:1实验分组:将生长状况良好的细胞支架复合物分为7组:对照组,每天加载0.5h持续4d组,每天加载0.5h持续8d组,每天加载0.5h持续12d组,每天加载2h持续4d组,每天加载2h持续8d组,每天加载2h持续12d组。2有限元分析细胞支架复合物受力分布情况。3 Hoechst/PI荧光双染法观察支架-细胞复合物成骨细胞凋亡情况。4采用CCK-8试剂盒检测三维培养成骨细胞增殖活性。5采用AKP、LDH和Caspase-3活性检测试剂盒测定成骨细胞分化、乳酸脱氢酶的外漏量及凋亡标志物Caspase-3活性。6 Realtime RT-PCR方法检测Caspase-3,9的基因表达水平。7 Western Blot方法检测Caspase-3,9的蛋白水平。结果:1当表观应变为10000με时,4000με以上应变占60%,因此在三维过载力学培养环节,选择表观应变为10000με的力学加载强度。2在荧光显微镜下可观察到,对照组细胞偶见红染细胞;每天加载0.5h持续4d、8d组以及每天加载2h持续4d组细胞核形态与对照组大致相同,可见少量红色死亡细胞;每天加载0.5h持续12d以及每天加载2h持续8d和12d组可见凋亡小体并且可见大量红色死亡细胞。3每天加载0.5h持续4d、8d组和每天加载2h持续4d组,CCK-8检测OD值显著升高(P0.05),而每天加载0.5h,持续12d组和每天加载2h,持续8d、12d组,OD值显著下降(P0.05)。力学加载前8d,每天加载0.5h组OD值明显高于2h组(P0.05),而加载至12d时,两组别无显著性差异(P0.05)。4正常对照组与0.5h、2h组AKP表达量有显著性差异(P0.05),0.5h组与2h组之间AKP表达量无显著性差异(P0.05);4d、8d、12d与0d相比AKP表达量均升高,4d与8d之间表达量无统计学差异(P0.05),而12d比其余组均升高(P0.05)。5正常对照组、0.5h及2h三组LDH外漏量均有显著性差异(P0.05),2h组明显高于正常对照组和0.5h组;0、4、8、12d四组LDH外漏量均有显著性差异(P0.05)。6与加载0d组相比,除每天加载0.5h,持续4d组之外,其余各组Caspase-3活性均升高(P0.05);持续加载至第4天时,每天加载2h组Caspase-3活性显著高于0.5h组(P0.05),其余每天两时间点间均无统计学差异(P0.05);0.5h组在第8天开始Caspase-3活性显著升高,在第12天与2h组无差异。7与正常对照组相比,各力学加载组caspase-3基因表达量明显升高(P0.05),加载4d时每天加载2h组caspase-3基因表达量明显高于每天加载0.5h组;与正常对照组相比,各力学加载组caspase-9基因表达量明显升高(P0.05),加载8d时每天加载2h组caspase-9基因表达量明显高于每天加载0.5h组。8与正常对照组相比,模型组加载第8、12天,caspase-9、caspase-3蛋白表达量明显升高,且每天加载2h各组蛋白表达量明显高于每天加载0.5h组。第二部分过载力诱导成骨细胞凋亡的机制研究目的:通过研究过载力作用下细胞膜上钙离子通道、细胞外ATP浓度对细胞内钙离子浓度及细胞凋亡的影响,探讨应力性骨折的发病机制。方法:1实验分组:随机取生长状况良好的细胞支架复合物分为不受力组(正常对照组(分化诱导培养基),加入维拉帕米组(分化诱导培养基),Hank?s培养基对照组,Hank?s培养基中加入NEM组),过载力加载1天组(分化诱导培养基组,Hank?s培养基组,分化诱导培养基加入维拉帕米组,Hank?s培养基中加入NEM组),过载力加载8天组(分化诱导培养基,分化诱导培养基加入维拉帕米组,分化诱导培养基加入NEM组)。2 Fluo-4-AM荧光标记法测定细胞内游离钙离子浓度。3 ATP活性测定试剂盒测定细胞外ATP活性。4 Realtime RT-PCR方法测定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2基因表达量。5 Western Blot方法测定Caspase-9、Caspase-3、Bax/Bcl-2蛋白的表达量。结果:1每天加载过载力2h,第一天细胞内游离钙离子浓度及细胞外ATP含量均显著高于正常对照组(P0.05),第二天ATP含量与正常对照组无显著性差异(P0.05),第三天开始ATP含量显著低于正常对照组(P0.05)。除第四天外,其余各时间点细胞内钙离子浓度均显著升高(P0.05),且呈时间依赖趋势。2过载力作用1d,细胞内钙离子浓度和ATP含量显著升高,加入细胞胞吐作用抑制剂NEM可以显著抑制这种效应。加入钙离子通道阻断剂维拉帕米(细胞膜上)可以降低细胞外ATP含量及细胞内钙离子浓度(P0.05)。3过载力作用第8天,加入NEM对细胞外ATP含量及细胞内钙离子浓度影响与对照组相比无显著性差异(P0.05);但加入维拉帕米后,细胞外ATP含量及细胞内钙离子浓度与对照组相比显著降低(P0.05)。4过载力作用第8天,细胞Caspase-3,Caspase-9以及Bax/Bcl-2比值的蛋白及m RNA表达量均显著高于正常对照组(P0.05),维拉帕米可以显著下调在过载力环境下的细胞内凋亡基因及蛋白的表达(P0.05),但对正常细胞无显著影响。第三部分野蔷薇苷对抗过载力诱导的成骨细胞凋亡及机制目的:通过研究过载力作用下细胞内钙离子浓度的变化,探讨野蔷薇苷对抗过载力刺激导致的细胞凋亡的作用及机制。方法:1实验分组:本部分实验在研究不同浓度野蔷薇苷对过载力诱导的成骨细胞凋亡模型的作用时,将生长状况良好的细胞支架复合物分为6组,分别为:正常对照组(不加力),过载力加载模型组,野蔷薇苷浓度为1×10-6mol/L组、1×10-8 mol/L组、1×10-10 mol/L组和1×10-12 mol/L组,均在力学加载装置中加载10000με每天2h,持续8d;在研究野蔷薇苷对抗过载力诱导的成骨细胞凋亡机制时,将生长状况良好的细胞支架复合物分为4组,分别为正常对照组,过载力加载模型组,维拉帕米(1×10-8 mol/L)组,野蔷薇苷(1×10-8 mol/L)组,对照组不做力学加载,在同样条件下培养8d,其余3组均在力学加载装置中加载10000με每天2h,持续8d。2 Hoechst/PI荧光双染法观察野蔷薇苷抗凋亡作用。3采用CCK-8方法测定OD值评价细胞增殖情况。4测定Caspase-3活性评价野蔷薇苷抗凋亡基因活化情况。5测定LDH外漏量评价不同条件下细胞损伤情况。6测定细胞内游离钙离子浓度评价野蔷薇苷抗凋亡机制。7 Realtime RT-PCR方法测定细胞内Caspase-9,Caspase-3,Bcl-2和Bax基因表达情况。8 Western Blot方法测定细胞内Caspase-9,Caspase-3,Cyt-C,Bcl-2和Bax蛋白表达情况。结果:1荧光显微镜下可见,正常对照组细胞偶见红染细胞;过载力加载模型组可见细胞核皱缩,细胞形状不规整,出现凋亡小体并且可见大量红染细胞;与模型组相比,各加药组尤其是野蔷薇苷1×10-8 mol/L和1×10-10mol/L组红染细胞数量明显减少。2与对照组相比,过载力加载模型组显著降低(P0.05),与模型组相比,各浓度野蔷薇苷均能显著升高细胞活力(P0.05),其中1×10-10mol/L组最高。3各浓度野蔷薇苷组LDH值均显著低于模型组(P0.05)。4与对照组相比,过载力加载模型组Caspase-3活性显著升高(P0.05);加入野蔷薇苷可明显降低Caspase-3活化程度(P0.05);其中1×10-8 mol/L和1×10-10 mol/L组Caspase-3活性低于1×10-6 mol/L和1×10-12 mol/L组。5与对照组相比,过载力加载模型组Caspase-3和Caspase-9 m RNA及其蛋白水平明显升高(P0.05);加入野蔷薇苷后Caspase-3和Caspase-9m RNA和蛋白水平明显降低(P0.05)。6与对照组相比,过载力加载模型组细胞内钙离子浓度显著升高(P0.05),维拉帕米和野蔷薇苷均能阻止细胞内钙离子升高(P0.05)。7与对照组相比,过载力加载模型组Caspase-3,Caspase-9 m RNA表达水平以及Bax/Bcl-2的比值均显著升高(P0.05);与模型组相比,维拉帕米组除Caspase-9外,其余均显著性降低(P0.05);野蔷薇苷组Caspase-3,Caspase-9 m RNA表达水平以及Bax/Bcl-2的比值与模型组均显著性降低(P0.05)。8与对照组相比,过载力加载模型组细胞Caspase-3,Caspase-9,Bax及Cyt-C蛋白水平显著升高,Bcl-2显著降低;与模型组相比,维拉帕米组和野蔷薇苷组Caspase-3,Caspase-9,Bax及Cyt-C蛋白水平显著降低,Bcl-2蛋白水平显著升高。结论:1过载力刺激对成骨细胞有“双向刺激”作用,短期作用能刺激成骨细胞增殖分化,长期作用则导致成骨细胞凋亡。2短期过载力刺激促进细胞膜上钙离子通道的开放和促进ATP向基质分泌,共同促进细胞内游离钙离子浓度升高,长期过载力刺激仅作用于细胞膜上钙离子通道的开放导致细胞内出现钙超载。3适当浓度的野蔷薇苷能有效降低细胞内游离钙离子浓度,下调细胞凋亡基因的表达,对抗长期过载力刺激导致的成骨细胞凋亡。
【图文】：

图 1 有限元分析不同表观应力下 PCL 材料应力分布Fig. 1 Finite element analysis of a PCLscaffold in different apparent stress.

图 1 有限元分析不同表观应力下 PCL 材料应力分布Fig. 1 Finite element analysis of a PCLscaffold in different apparent stress.
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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