【摘要】：肝癌是常见的恶性肿瘤之一,其中来源于肝细胞的肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)最为常见。肝癌一般是由慢性肝病引起的肝细胞损伤,如慢性肝炎导致的肝组织纤维化、肝硬化,最后导致肝细胞癌。传统的治疗手段有手术、介入、放疗、化疗以及生物免疫治疗等。寻找有效的治疗药物,并对肝病的发病机理和药物的作用机制进行研究,是非常受重视的研究方向之一。苦参碱(Matrine)是从豆科属植物苦参的干燥根中分离出来的生物碱,具有广泛的药理学活性,如抗菌消炎、镇痛、免疫调节、抗心律失常、抗肝纤维化、抗肿瘤活性,在临床上可以治疗肝纤维化,慢性乙肝等疾病。苦参碱抗肿瘤活性的机制是多方面的,如抑制肿瘤细胞的增殖,促进细胞凋亡,抑制肿瘤细胞的侵袭,抑制肿瘤组织内部微血管的生成,诱导肿瘤细胞分化等,并且具有免疫调节以及降低化疗、放疗带来的毒性等作用。M-19是近年来重点研究的一个新型硫代苦参碱衍生物,其药理活性广泛,尤其对多种肿瘤细胞具有较强的抑制活性,其活性远强于苦参碱,但是M-19有与苦参碱一样的缺点,水溶性好,它的稳定性还不如苦参碱,很容易分解。在前期研究的基础之上,我们以苦参碱和苦参碱衍生物M-19为先导化合物,以槐果碱为起始原料,保留基本药效基团,向结构中引入药物设计中常见的有效结构片段,合成了多个系列的新化合物,并从中筛选到了编号为WM622的高活性、低毒性的新型苦参碱衍生物。我们对化合物WM622进行了深入的药理研究,发现其对HCC-LM3和Hep3B细胞有很好的活性。在体外的细胞实验中,WM622对肝癌细胞的增殖有着显著的抑制作用,能够抑制肿瘤细胞迁移,促进细胞凋亡,将细胞周期阻滞在G0/G1期。通过计算机辅助的药物设计的手段,对WM622与靶点蛋白的作用进行了计算机模拟对接,推测其与EGFR和PTEN蛋白结合的匹配性较好,并通过实验证实了其对EGFR-AKT/PI3K通路具有抑制作用。在荷瘤小鼠体内,WM622对肿瘤的生长有明显的抑制作用。从而为抗肝癌药物的研究提供了新的机理和研究基础。研究方法:1、苦参碱衍生物的合成以及抗肿瘤活性筛选。我们以苦参碱和苦参碱衍生物M-19为先导化合物,合成了三类新型苦参碱衍生物,并用MTT法测定了0.1mg/mL浓度下各个化合物对不同肝癌细胞系的抑制率,筛选出对肝癌细胞有抑制作用的化合物。检测并计算这一批化合物对肝癌细胞的IC_(50),筛选出抗肿瘤活性高的化合物和敏感细胞系。2、WM622体外抑制肝癌细胞以及肝癌干细胞作用的研究。为了检测WM622对肝癌细胞以及肝癌干细胞的抑制作用,我们从以下几个方面进行了研究:(1)通过MTT比色法和平板克隆形成实验,检测WM622对肝癌细胞增殖的作用;(2)通过细胞划痕愈合实验和Transwell小室实验,检测WM622对肝癌细胞迁移的作用;(3)通过Hoechst 33258染色以及PI、AV/FITC双染的方法,使用流式细胞术检测WM622处理过的肿瘤细胞中凋亡细胞所占的比例,评价WM622对肝癌细胞凋亡的作用;(4)通过PI染色以及流式细胞术检测WM622处理过的肿瘤细胞中各个周期细胞所占的比例,分析WM622对肝癌细胞周期的影响;(5)通过磁珠分选的方法,获得CD133~+细胞系,通过成球实验验证其干性,检测WM622对CD133~+和CD133~-细胞成球和细胞增殖的影响。3、WM622抑制肝癌细胞分子机制的研究。我们先通过计算机辅助药物设计的方法,寻找WM622可能作用的靶点蛋白和信号通路。然后用Western Blot的方法对结果进行验证,研究WM622在抗癌过程中的具体机制。4、WM622体内抗肝癌作用效果的研究。我们先将HCC-LM3细胞悬液皮下注射于四周龄的BALB/c裸鼠背部,建立BALB/c裸鼠成瘤模型。设置高浓度药物组(34mg/kg)、低浓度药物组(17 mg/kg)、5-Fu组(20 mg/kg)及空白对照组(PBS),隔一天进行腹腔注射给药。给药10次后采取小鼠肿瘤组织,绘制肿瘤增长曲线和小鼠体重变化曲线。组织切片HE染色的方法观察肿瘤组织结构。通过免疫组织化学染色,以及Western Blot的方法,检测肿瘤组织中相关通路关键蛋白的表达量变化。研究结果:1、苦参碱衍生物的合成以及抗肿瘤活性筛选。我们合成了三类苦参碱衍生物,MTT法检测了各个化合物在0.1 mg/mL的浓度下对6种肝癌细胞系的抑制率。分别计算这批化合物对4种肝癌细胞的IC_(50),从中筛选出了抗肿瘤活性最好的化合物WM622以及敏感细胞系HCC-LM3和Hep3B。2、WM622体外抑制肝癌细胞以及肝癌干细胞作用的研究。这部分的研究中,我们得到以下结论:(1)WM622对肝癌细胞系HCC-LM3和Hep3B的抑制率随着浓度和时间的增加而升高,对正常肝细胞系的毒性低于对肝癌细胞系的毒性,随着WM622浓度的增加,HCC-LM3和Hep3B的平板克隆形成率显著下降;(2)随着WM622浓度的增加,HCC-LM3和Hep3B的划痕实验愈合面积显著减少,Transwell细胞数显著减少;(3)经Hoechst 33258染色后,荧光显微镜下观察到凋亡细胞的亮白色呈分散的碎颗粒状或棒状细胞核,随着WM622浓度的增加,凋亡细胞的数目逐渐增多;(4)PI和AV-FITC染色后,流式细胞仪检测到的凋亡细胞所占的比例增多,G1期细胞所占的比例增加,提示WM622能够将细胞周期阻滞在G0/G1期;(5)通过磁珠分选的方法,将肝癌细胞系分为CD133~+细胞和CD133~-细胞,CD133~+细胞的成球率显著高于CD133~-细胞。WM622能够浓度依赖地抑制CD133~+细胞的成球和增殖能力。3、WM622抑制肝癌细胞分子机制的研究。我们通过计算机辅助药物设计的方法,推测出了WM622与EGFR、PTEN结合的匹配性较好,并用Western Blot的方法进一步验证了WM622能够抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。4、WM622体内抗肝癌作用效果的研究。我们得出,随着WM622给药时间的延长,可以看到肿瘤体积增长幅度越来越小。光镜下观察肿瘤组织的HE染色切片,可见细胞核质比大,胞核深染,组织结构散乱等肿瘤组织的一般形态学特征。通过免疫组织化学和Western Blot的方法,验证了WM622能够抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。结论:在体外,WM622能够剂量和时间依赖地抑制肝癌细胞系HCC-LM3和Hep3B的增殖、迁移,促进肿瘤细胞的凋亡,将肿瘤细胞的周期阻滞在G0/G1期。能够抑制肿瘤干细胞的增殖。在体内,WM622能够剂量依赖地抑制肿瘤的生长。WM622作用的机制是抑制肿瘤细胞的EGFR-PI3K/AKT通路。
【学位授予单位】：中国人民解放军海军军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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