【摘要】:目的:卒中具有高发病率、高致残率、高死亡率等特性,是欧美国家第二大死亡原因,在中国,卒中是人类死亡的最主要原因,急性缺血性卒中(acute ischemic stroke,AIS)约占全部卒中的80%。目前卒中的研究聚焦于如何高效的修复AIS后神经损伤。以前人们往往觉得大脑中的神经元是不具备再生能力的。神经干细胞(Neural stem cells,NSCs)的发现为神经修复带来新希望。开窍醒神中药麝香广泛用于缺血中风治疗,但其促进神经再生的机制尚不明确。本研究运用脑缺血/再灌注(MCAO)模型,采用分子生物学、干细胞等技术,观察“开窍醒神“法对于内源性NSC增殖分化的影响,分析“开窍醒神”法干预内源性NSC增殖分化的分子机制,揭示中医“开窍醒神”法实质,丰富中医治疗中风病的理论。方法:1.实验动物SPF级雌性SD大鼠90只,体重250-300 g,按随机数字表分为6组,高、中、低浓度组各24只,再分为1、3、7、14d组,假手术组、模型组、空白对照组各6只。模型组、假手术组、空白对照组给予生理盐水灌胃,麝香酮高、中、低剂量组分别给予1mg/kg、2mg/kg、4mg/kg灌胃,按10ml/kg体重的体积灌胃给药,每日灌胃1次。2.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N蛋白表达的影响复制大鼠 MCAO模型,高(16.8μL/100g)中(8.2μL/100g)低(4.2μμL/100 g)剂量麝香酮混悬液连续灌胃1d、3d、7d、14d后处死,分离侧脑室下区(subventricular zone,SVZ)脑组织,蛋白质免疫印迹法检测神经元特异性核蛋白Neu-N、胶质纤维酸性蛋白GFAP蛋白表达,用Image Lab显影成像并进行数据分析,比较分析各组大鼠蛋白表达的差异。3.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N细胞增殖分化的影响复制大鼠 MCAO模型,高(16.8μ L/100g)中(8.2μL/100g)低(4.2μL/100 g)剂量麝香酮混悬液连续灌胃1d、3d、7d、14d后处死,分离侧脑室下区脑组织,多聚甲醛固定、包埋及切片后进行免疫荧光染色,荧光显微镜下观察,分析各组大鼠神经元标志物Neu-n、星形胶质细胞标志物GFAP 阳性细胞计数的表达差异。结果:1.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N蛋白表达的影响蛋白印迹结果提示,在MCAO大鼠SVZ区发现有GFAP、Neu-N蛋白的增殖,与模型组比较,中高浓度组GFAP、Neu-N蛋白表达差异具有统计学意义(P0.01),可见不同浓度的麝香酮作用于MCAO大鼠,GFAP蛋白表达随药物浓度的递增而呈递减趋势,Neu-N蛋白表达随药物浓度的递增而呈递增趋势。在MCAO大鼠侧脑室发现有GFAP、Neu-N蛋白的沉积;麝香酮呈浓度依赖性下调MCAO大鼠侧脑室GFAP蛋白表达;麝香酮呈浓度依赖性上调MCAO大鼠侧脑室Neu-N蛋白的表达。2.麝香酮对MCAO大鼠侧脑室下区GFAP、Neu-N细胞增殖分化的影响结果显示,星形胶质细胞计数依次为:高浓度麝香酮组(33.67±5.86)个/视野、中浓度麝香酮组(39.67±5.13)个/视野、低浓度麝香酮组(55.33±2.31)个/视野、模型组(50.67 ±2.08)个/视野、假手术组(56.33 ±9.0)个/视野、空白对照组(58.33± 1.53)个/视野,与空白对照组比较,模型组、低浓度麝香酮组大鼠星型胶质细胞激活计数明显减少,差异具有统计学意义(P0.01)。与模型组大鼠比较,中高浓度麝香酮组大鼠的星形胶质细胞激活数显著减少,差异有显著统计学意义(P0.01)。神经元细胞计数依次为:高浓度麝香酮组(110.67±37.2)个/视野、中浓度麝香酮组(91.33±36.95)个/视野、低浓度麝香酮组(69.33±20.79)个/视野、模型组(54.33±13.15)个/视野、假手术组(24.33±8.62)个/视野、空白对照组(12.33±9.29)个/视野,与空白对照组比较,模型组、低浓度麝香酮组大鼠神经元细胞激活计数明显增多,差异具有统计学意义(P0.01)。与模型组大鼠比较,高浓度麝香酮组大鼠的星形胶质细胞计数显著增多,差异有显著统计学意义(P0.01)。结论:1、脑缺血再灌注后大鼠脑组织自发地促进神经干细胞的增殖,可以诱导神经干细胞向缺血区皮质和纹状体迁移,从而分化为神经元(Neu-N标记的阳性细胞)和神经胶质细胞(GFAP标记的阳性细胞),但数目较少。2、经麝香酮灌胃治疗后,内源性NSCs增殖明显,并分化为神经元,而分化为星形胶质细胞数量较模型对照组少。3、麝香酮能促进MCAO大鼠ENSCs的增殖,并且使神经干细胞向神经元分化增加,减少神经干细胞向星形胶质细胞的分化;高浓度麝香酮具有更强的促进NSC增殖分化的能力。
【图文】: 高浓度组GFAP、Neu-N蛋白表达差异具有统计学意义(户<0.01),可见不同逡逑浓度的麝香酮作用于MCA0大鼠,,GFAP蛋白表达随药物浓度的递增而呈递减趋势,逡逑Neu-N蛋白表达随药物浓度的递增而呈递增趋势。详见表1、图2。逡逑表1麝香酮对MCA0大鼠SVZ区GFAP、Neu-N蛋白表达影响(3F±x,n=3)逡逑M31逦iiS逦Neu-n逦GFAP逡逑/mg邋?邋kg逡逑逦^逦逡逑麝香酮高浓度逦4逦1.43邋+邋0.07逦1.00+0.00逡逑组逡逑麝香酮中浓度逦2逦1.08±0.24逦1.60±0.43逡逑组逡逑麝香酮低浓度逦1逦0.92±0.52逦3.20±1.37逡逑组逡逑模型+NS邋组逦-逦0.59±0.邋10逦0.06±0.09逡逑假手术组逦-逦0.52±0.45逦0.67±0.邋10逡逑空白对照组逦-逦0.51±0.10逦2.94±0.邋10逡逑厂值逦11.578逦3.174逡逑尸值逦0.000逦0.047逡逑注:与模型组比较,GFAP蛋白低、中浓度组尸值为0.邋020、0.017,★P<0.邋05,高浓度组尸值为逡逑0.001,逦与模型组比较,Neu-N中浓度组P值为0.012,邋*P<0.05,低、高浓度组b6逡逑值为邋0.000、0.001,邋**户<0_邋01。逡逑24逡逑
图5各组大鼠星型胶质细胞及神经元细胞计数逡逑注:A:星型胶质细胞计数;B:神经元细胞计数;与正常组比较,F<0.邋01;与模型组比较,逡逑0.邋01;逡逑六、讨论逡逑大脑动脉阻塞或脑部血管破裂导致急性脑血管幨件发牛,|〖|丨6脑血符疾病发牛.。逡逑缺少白细胞血小板的血液流向大脑随后导致细胞死亡。脑血管疾病+:要有以卜3种:逡逑缺血性中风,出血性中风和短暂性脑缺血发作(T】A)。脑血管疾病的高发病率在世界范逡逑围内很大程度上是由于失畋的管理和预防可缓和的危险因索,尤其是在缺血性中风中,逡逑占〉脑血管疾病总数的8;5%。脑血管疾病更常见的影响超重的人,年龄彡55岁,有-个逡逑33逡逑
【学位授予单位】:广州中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:R285.5
【参考文献】
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