【摘要】：目 的:通过观察胡椒碱对C57BL/6小鼠胆固醇结石形成的影响,检测血清及胆汁中脂质水平的表达,以LRH-1调控肝脏胆固醇转运体相关信号通路作为切入点,揭示胡椒碱抑制胆囊胆固醇结石形成及部分生物学机制,为临床预防胆囊胆固醇结石病药物的研发提供实验依据。材料与方法:1.实验动物 选取SPF级雄性C57BL/6小鼠90只,10-14周龄,体重为20±2g,分笼饲养,适应性饲养7天后,随机分为6组,即空白组、模型组、熊去氧胆酸组(90 mg·kg-1)、胡椒碱低剂量组(20 mg·kg-1)、胡椒碱中剂量组(40 mg·kg-1)和胡椒碱高剂量组(60 mg·kg-1),每组15只。2.造模及用药干预造模同时用药干预。除空白组喂食普通饲料外,其余各组均喂食高脂饲料(基础饲料+2%胆固醇+0.5%胆酸+15%牛油)。阳性对照组药物剂量根据小鼠与成人体重等效剂量换算。空白组和模型组每天上午10:00给予等量的0.5%CMC-Na溶液灌胃,熊去氧胆酸组每天上午10:00给予熊去氧胆酸溶液灌胃,胡椒碱各剂量组按剂量要求每天上午10:00给予等量的溶于0.5%CMC-Na的胡椒碱灌胃。饲养4周。3.取材 取材实验前,小鼠禁食禁水12 h,称重,记录。采用摘眼球取血的方法收集血液;打开腹腔,观察胆固醇结石成石情况并计算结石发生率(简称结石率);以游标卡尺测量胆囊长径和宽径,计算胆囊容积,并收集胆囊胆汁;切取全部肝脏组织冻存于-80℃冰箱备用。4.检测指标(1)小鼠一般状态观察:观察各组小鼠皮毛、活动能力、反应能力等一般状态。(2)计算各组小鼠胆囊结石成石率:胆囊结石成石率(%)=每组生成胆囊结石小鼠数/每组小鼠数× 1 00%;(3)计算各组小鼠胆囊容积:胆囊容积根据椭圆公式计算:容积(μL)=长径(mm)×宽径(mm)×深径(mm)×π/6(近似认为胆囊宽径等于深径);(4)采用全自动生化分析仪检测各组小鼠胆汁中的TC、TBA、PL含量,根据三者含量,计算CSI;(5)采用全自动生化分析仪检测各组小鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C的含量;(6)采用Western-blot技术检测各组小鼠肝脏组织中LRH-1、SRBI、ABCG5、ABCG8的蛋白含量;(7)采用荧光定量PCR技术检测各组小鼠肝脏组织中LRH-1、SRBI、ABCG5、ABCG8的mRNA含量表达。结 果:1.胡椒碱对C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石成石的影响 1.1各组小鼠一般状态情况 各组小鼠活泼好动,毛色光亮,精神状态及食欲均好。各组小鼠无死亡情况出现。1.2各组小鼠成石率的比较 各组小鼠成石率:空白组、模型组、熊去氧胆酸组,胡椒碱低、中、高组结石率分别为0%、100%、20%、80%、46.7%、13.3%。与模型组相比,胡椒碱低剂量组成石率未有明显改变(P0.05),其余各组均有统计学意义(P0.05)。2.胡椒碱对C57BL/6小鼠血清中脂质水平的影响2.1各组小鼠胆囊容积的比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组和胡椒碱低、中、高各组小鼠胆囊容积明显增大(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中剂量组和胡椒碱高剂量组小鼠胆囊容积明显减小(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组小鼠胆囊容积明显增大(P0.05),胡椒碱高剂量组小鼠胆囊容积明显减小(P0.05)。2.2各组小鼠胆囊胆汁中CSI的比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组、胡椒碱低、中、高各组小鼠CSI值明显升高(P0.05),且模型组与胡椒碱低剂量组的CSI1,提示为胆固醇过饱和胆汁;与模型组相比,熊去氧胆酸组与胡椒碱组的CSI值明显降低(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组CSI值明显升高(P0.05),胡椒碱高剂量组CSI值明显降低(P0.05)。2.3各组小鼠血清中TC、TG含量的比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组以及胡椒碱低、中、高各组小鼠TC含量明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组TC含量明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组TC含量明显升高(P0.05)。与空白组比较,模型组TG含量明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组TG含量明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组TG含量明显升高(P0.05)。2.4各组小鼠血清中LDL-C、HDL-C含量的比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组以及胡椒碱低、中、高各组小鼠LDL-C含量明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组LDL-C含量明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组LDL-C含量明显升高(P0.05)。与空白组相比,模型组和胡椒碱低剂量组HDL-C含量明显下降(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组和胡椒碱中、高剂量组HDL-C含量明显升高(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组HDL-C含量明显下降(P0.05)。3.胡椒碱对胆固醇结石小鼠肝脏LRH-1/SRBI及LRH-1/ABCG5/ABCG8信号通路的影响3.1各组小鼠肝脏组织LRH-1的蛋白表达比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组和胡椒碱低、中剂量组LRH-1的蛋白表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组LRH-1的蛋白表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组LRH-1的蛋白表达明显升高(P0.05),胡椒碱高剂量组LRH-1的蛋白表达明显下降(P0.05)。3.2各组小鼠肝脏组织SRBI的蛋白表达比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组和胡椒碱低、中剂量组SRBI的蛋白表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组SRBI的蛋白表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组SRBI的蛋白表达明显升高(P0.05),胡椒碱高剂量组SRBI的蛋白表达明显下降(P0.05)。3.3各组小鼠肝脏组织ABCG5蛋白表达比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组和胡椒碱低、中剂量组ABCG5的蛋白表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组ABCG5的蛋白表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组ABCG5的蛋白表达明显升高(P0.05),胡椒碱高剂量组ABCG5的蛋白表达明显下降(P0.05)。3.4各组小鼠肝脏组织ABCG8的蛋白表达比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组和胡椒碱低、中剂量组ABCG8的蛋白表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组ABCG8的蛋白表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组ABCG8的蛋白表达明显升高(P0.05)。3.5各组小鼠肝脏组织LRH-1的mRNA表达比较 与空白组相比,模型组、熊去氧胆酸组、胡椒碱低、中、高剂量组LRH-1的mRNA表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组LRH-1的mRNA表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组LRH-1、的mRNA表达明显升高(P0.05)。3.6各组小鼠肝脏组织SRBI的mRNA表达比较 与空白组相比,模型组、胡椒碱低、中剂量组SRBI的mRNA表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组SRBI的mRNA表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组SRBI的mRNA表达明显升高(P0.05)。3.7各组小鼠肝脏组织ABCG5的mRNA表达比较 与空白组相比,模型组、胡椒碱低、中剂量组ABCG5的mRNA表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组ABCG5的mRNA表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低剂量组ABCG5的mRNA表达明显升高(P0.05)。3.8各组小鼠肝脏组织ABCG8的mRNA表达比较 与空白组相比,模型组、胡椒碱低、中、高剂量组ABCG8的mRNA表达明显上升(P0.05);与模型组相比,熊去氧胆酸组、胡椒碱中、高剂量组ABCG8的mRNA表达明显下降(P0.05);与熊去氧胆酸组相比,胡椒碱低、中剂量组ABCG8的mRNA表达明显升高(P0.05)。结论:本实验通过观察胡椒碱对C57BL/6小鼠胆固醇结石形成的影响,证实胡椒碱中、高(40mg·kg-1,60mg·kg-1)剂量组可能通过抑制肝脏组织LRH-1/SRBI及LRH-1/ABCG5/ABCG8信号通路的表达,改善血清中的脂质代谢异常,进而能够抑制高脂饲料诱导的C57BL/6小鼠胆囊胆固醇结石的形成,且胡椒碱高剂量组优于胡椒碱中剂量组。
【图文】：
其余各组与模型组相比，，差异均具有统计学意义（P＜0.05）。各组小鼠胆固醇结石率比较见表 1。图1 空白组与模型组胆囊结石成石状态注：A：空白组，B：模型组
图 2 各组小鼠胆囊容积比较（n=15，x±s）注：aP<0.05 与空白组相比；bP<0.05 与模型组相比；cP<0.05 与熊去氧胆酸组相比。.各组小鼠胆囊胆汁 CSI 水平比较与空白组相比，模型组、熊去氧胆酸组、胡椒碱组 CSI 数值出现明显升高（P＜0.05
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5
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