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生脉散在细颗粒物促发心肌缺血性损伤中的保护作用及机制初探

发布时间:2020-05-03 13:03
【摘要】:目的:大气污染细颗粒物暴露与心血管疾病的发病率和死亡率存在着明确的因果关系,被视为心血管疾病可改变危险因素。我国境内长期大气污染细颗粒物高浓度暴露使公民身体健康存在极大风险。在前期研究基础上,通过建立体内和体外大鼠心肌缺血损伤模型,观察生脉散(SM)对细颗粒物(Standard Reference Material 1650b:Diesel Particulate Matter,DPM)致心肌缺血性损伤的保护作用,探讨SM对该损伤的保护作用及初步机制。方法:1.建立DPM染毒致体内心肌缺血损伤模型,造模前给予SM一周,一次性气管滴注DPM混悬液(急性暴露),24 h后行大鼠冠状动脉左前降支结扎术,术后观察SM对大鼠心脏的保护作用并初步探讨机制。2.通过Langendorff灌流系统建立离体心脏缺血再灌注模型,给予SM和DPM混悬液,后进行全心缺血再灌注,观察DPM对大鼠心脏的直接损伤和SM的保护作用。3.建立DPM损伤心肌细胞H9c2模型,观察SM对该损伤的线粒体功能及Nrf2通路的影响。体内实验:SD大鼠随机分为假手术组、模型组、SM低剂量组、SM中剂量组、SM高剂量组。SM灌胃给药一周,假手术组和模型组灌胃给予等体积0.9%生理盐水;后行气管滴注DPM混悬液100μg/kg进行染毒,24 h后将大鼠麻醉行冠状动脉左前降支结扎手术,结扎24 h后,腹主动脉取血,使用生化试剂盒检测血清中LDH、CK-MB含量;检测抗氧化指标SOD、MDA、CAT、GSH-Px、NOX含量;采用酶联免疫分析(ELISA)检测血清中cTnT含量;心肌组织切片后采用TTC染色法评价心脏梗死面积,HE染色观察病理学变化,透射电镜观察心肌组织及线粒体超微结构;采用qPCR芯片检测线粒体氧化应激差异蛋白,qPCR检测Nrf2及下游基因的表达。离体实验:SD大鼠称重后随机分为正常对照组、维拉帕米阳性药组、模型组、SM 0.14mg/mL组、SM 0.28 mg/mL组。SD麻醉后开胸剪下完整心脏,将心脏悬挂于Langendorff主动脉套管上,并逆行灌注。对K-H液37℃、95%O_2-5%CO_2混合气持续氧合。将自制球囊插入左心室,压力传感器连接多导生理记录仪,全程记录灌注压(PP)、心电图及心室压力曲线。平衡后给药灌流10 min,灌注10μg/mL DPM混悬液30 mL,全心缺血40 min再灌注40 min,检测HR、LVEDP、LVSP并计算LVDP、±dp/dt_(max)、RPP;留取再灌注末期心脏冠脉流出液检测cTnT含量。细胞实验:采用DPM 100μg/mL作用24 h染毒H9c2心肌细胞作为细胞损伤模型,采用CCK8检测SM对DPM所致损伤的作用。采用DCFH-DA探针检测细胞内ROS产生量,JC-1探针检测线粒体膜电位,XFe能量代谢仪器定量检测线粒体呼吸,评价SM对DPM染毒的线粒体功能的影响。结果:1.体内实验:(1)与假手术组相比,DPM致大鼠心肌面积梗死面积显著增大(P0.001),LDH、CK-MB、cTnT含量显著增高;心肌组织病理学见血管与心肌纤维间隙增大,炎性细胞浸润,局部心肌纤维水肿;心肌超微结构有部分心肌细胞水肿,肌小节明暗带模糊不清,线粒体出现肿胀和嵴溶解。与模型组相比,SM组梗死面积显著减小(P0.001);LDH、CK-MB、cTnT含量显著降低;组织病理学炎性细胞浸润减少,心肌纤维间间隙减小,肌原纤维排列整齐,肌小节结构清晰;线粒体结构偶见肿胀,嵴结构致密规则;(2)与假手术组相比,模型组CAT、GSH-Px含量显著降低(P0.05),MDA、NOX含量显著升高(P0.01);与模型组相比,SM低剂量组CAT含量显著增高(P0.05),中剂量组GSH-Px含量显著增高(P0.05);SM各剂量组MDA、NOX含量显著降低(P0.05);(3)与假手术组相比,DPM致Cat、Gstk1基因显著下调,Ucp3基因下调,Cyba基因上调;与模型组相比,SM作用后Cat、Gstk1、Ucp3基因显著上调,Cyba基因下调;(4)与假手术组相比,DPM致Nrf2、HO-1、CAT、SOD1、GPX1、NQO1 mRNA相对表达水平明显降低(P0.05),NOX mRNA明显升高(P0.001),SM低剂量组CAT、GPX1相对表达水平明显升高(P0.05),NOX明显下降(P0.001),SM中剂量组CAT、SOD1、GPX1相对表达水平明显升高(P0.05)。2.离体实验:(1)与正常对照组比较,模型组DPM致离体大鼠心脏心电图ST段抬高,心率异常,PP显著升高(P0.01),LVDP、dp/dt_(max)、RPP显著降低(P0.001);(2)与模型组比较,SM对离体心脏功能未见显著保护作用,PP值下降,LVDP、dp/dt_(max)、RPP升高,无统计学差异;维拉帕米组PP显著下降(P0.05),dp/dt_(max)、LVDP、RPP显著升高(P0.001);(3)与正常对照组比较,模型组cTnT含量显著升高(P0.05);与模型组比较,SM 0.28 mg/mL使cTnT含量显著降低(P0.05)。3.细胞实验:(1)CCK8检测100μg/mL DPM对细胞作用后细胞的存活率为57%,SM作用后,细胞存活率均有增加,选择SM 0.28 mg/mL、SM 0.56 mg/mL、SM 1.12 mg/mL完成后续实验;(2)DPM染毒24 h后,细胞内ROS水平增高(P0.05);预处理SM可显著减少ROS的产生(P0.01);(3)DPM作用后,线粒体膜电位细胞内绿色荧光增多,膜电位下降;SM预处理后,细胞绿色荧光减少,膜电位升高,无统计学差异;(4)DPM作用后,线粒体基础呼吸值、ATP产生量、非线粒体呼吸消耗值增大,与正常组相比,有统计学差异(P0.05);SM预处理后,以上值均显著下降(P0.05),保护线粒体呼吸功能;结论:本研究证实DPM对心肌缺血性损伤有加重作用,损伤心肌细胞及线粒体功能,DPM作为外界刺激引起机体氧化应激,使机体相关抗氧化因子与Nrf2通路下游II相解毒酶表达异常,机体防御能力下降;同时,氧化应激产生过量ROS,进而影响线粒体功能,对线粒体呼吸的影响又产生更多ROS损伤心肌细胞;SM可能通过Nrf2通路调动机体抗氧化防御,平衡机体氧化应激水平,从而保护心脏功能,对DPM造成的损伤有良好的保护作用。
【图文】:

冠状动脉,位置


轻垫少许无菌棉球以保护左肺,然后用无菌棉球推开胸腺暴露出心耳和肺动脉圆锥。结扎位置:左心耳与肺动脉圆锥交界处下2-3 mm处,用4-0线穿过心肌冠状动脉左前降支结扎,具体位置见图1,在此束心肌表面放一根长约1cm、直径2 mm的细棉线,轻轻拉紧丝线两端,连同细棉线一同结扎冠状动脉前降支。对出血部位采用无菌棉止血后,,逐层关胸,在关胸过程中,随时用手挤压胸腔以排空胸腔中的空气,以防气胸。关胸后断开呼吸机,并帮助大鼠使其恢复自主呼吸,保温至其自然苏醒。图1 冠状动脉LAD结扎具体位置摘自 http://www.cmuh.cmu.edu.tw/web/showmedical.php?docid=893&id=11.2.4 取材方法心肌缺血结扎术后 24 h,大鼠麻醉后打开腹腔于腹主动脉取血 8 mL,3500rpm/min 离心 15 min,取血清-80℃冻存待测。将心肌组织切片进行 TTC 染色

心梗面积,占比,高显,硕士学位论文


山西医科大学硕士学位论文果中各片心肌组织的梗死区域面积与全部心肌面积的正反面进行计显示:假手术组心梗面积占比 10%,模型组为 50%,心梗面积明;SM 低剂量组心梗面积占比 26%,SM 中剂量组为 20%,SM 高显著小于模型组(P < 0.001),其中 SM 高剂量组减小比例最大。
【学位授予单位】:山西医科大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R285.5

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本文编号:2647570

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