杜鹃花总黄酮改善缺血性脑损伤的保护作用与脑基底动脉TRPV4、IKca及SKca通道的关系

发布时间：2020-05-04 05:55

【摘要】：目的:探讨杜鹃花总黄酮(TFR)改善缺血性脑损伤的保护作用与脑基底动脉瞬时受体电位通道4(TRPV4)、中电导的钙激活钾通道(IKca)、小电导的钙激活钾通道(SKca)的关系及可能存在的相关机制。方法:雄性SD(Sprague Dawley Rat)大鼠72只,8周龄,体质量(240±20)g,自由饮食与饮水。适应性喂养7天后,通过四血管阻断法(four-vessel occlusion,4-VO)构建全脑缺血再灌注(CIR)模型。将CIR大鼠随机分为CIR组(NS,n=8)、TFR组(100 mg/kg,n=8)、TFR+TRPV4阻断剂HC-067047组(100 mg/kg+10 mg/kg,n=8)、HC-067047组(10 mg/kg,n=8)、TFR+IKca阻断剂TRAM-34组(100mg/kg+0.5 mg/kg,n=8)、TRAM-34组(0.5 mg/kg,n=8)、TFR+SKca阻断剂Apamin组(100 mg/kg+0.3 mg/kg,n=8)、Apamin组(0.3 mg/kg,n=8),以SD大鼠为假手术组(NS,n=8)。于夹闭两侧颈总动脉前30 min尾静脉注射上述药物,造模完成24 h后处死大鼠。脑电波记录仪检测脑组织缺血前,缺血25 min及再灌注2 h大鼠脑电波;造模前称量大鼠体重,造模完成后取脑组织称量其湿重,比较各组大鼠大脑重量指数差异;大鼠腹主动脉取血,分离血清,采用ELISA法检测血清中MDA含量与LDH活性;HE及尼氏染色分别观察大脑皮层病理学改变;采用动脉加压灌注法,观察TFR对CIR大鼠CBA产生舒张作用的影响及TRPV4、IKca、SKca通道阻断剂对其产生的影响;Western blot法检测TFR对CIR大鼠脑基底动脉TRPV4、IKca、SKca通道蛋白表达的影响及各阻断剂对TRPV4、IKca、SKca通道蛋白表达的影响;RT-qPCR法检测TFR对CIR大鼠CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表达的影响及各阻断剂对TRPV4、IKca、SKca通道mRNA表达的影响;激光共聚焦检测TFR对CIR大鼠CBA平滑肌细胞Ca~(2+)浓度的影响以及TRPV4、IKca、SKca通道阻断剂对其产生的影响。结果:(1)与Sham组相比,CIR组大鼠缺血前脑电波无明显变化;当缺血25min时,脑电波逐渐变平,波动变缓,波幅变低;再灌注2 h后脑电波逐渐恢复。(2)与Sham组相比,CIR组大鼠大脑重量指数明显升高(P0.01);与CIR组相比,TFR组及TFR联用各通道阻断剂组大脑重量指数均呈不同程度降低(P0.01);与TFR组相比,TFR联用HC-067047组大脑重量指数明显升高(P0.05),TFR联用TRAM-34组、Apamin组略有升高,但差异无统计学意义(P0.05)。(3)ELISA法结果显示,CIR组与Sham组相比,大鼠血清中MDA含量及LDH活性显著升高(P0.01);与CIR组相比,TFR组及TFR联用各通道阻断剂组MDA含量及LDH活性显著降低(P0.05,P0.01);与TFR组相比,TFR联用各阻断剂组MDA含量及LDH活性均有所升高(P0.05,P0.01)。(4)HE及尼氏染色显示CIR大鼠脑组织大量细胞萎缩变性、胞核深染、胞质空泡、神经纤维崩解,TFR组及TFR联用各阻断剂组脑组织病理变化呈不同程度改善。(5)动脉加压灌注结果显示,累加浓度的TFR能剂量依赖性的舒张CIR大鼠CBA,而使用TRPV4、IKca、SKca通道阻断剂预处理后出现不同程度抑制血管舒张反应的现象。(6)Western blot法结果表明,CIR组较Sham组,大鼠CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表达水平显著降低(P0.01);与CIR组相比,TFR组CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表达水平显著升高(P0.01),联用各通道阻断剂组CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表达均有所升高(P0.05),单用各通道阻断剂组CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01);与TFR组相比,各联用通道阻断剂组CBA中TRPV4、IKca、SKca蛋白表达明显下降(P0.05,P0.01)。(7)RT-qPCR结果显示,CIR组较Sham组,大鼠CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表达显著降低(P0.01);与CIR组相比,TFR组CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表达显著升高(P0.01),联用各通道阻断剂组CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表达均有所升高(P0.01),单用各通道阻断剂组CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表达明显下降(P0.05,P0.01);与TFR组相比,联用各通道阻断剂组CBA中TRPV4、IKca、SKca mRNA表达明显下降(P0.05,P0.01)。(8)激光共聚焦结果显示,与Sham组相比,CIR组大鼠CBA平滑肌细胞Ca~(2+)荧光强度显著增强(P0.01);与CIR组相比,TFR组及TFR联用各阻断剂组Ca~(2+)荧光强度呈不同程度减弱(P0.05,P0.01);与TFR组比较,TFR联用各阻断剂组Ca~(2+)荧光强度明显增强(P0.01)。结论:TFR对全脑缺血再灌注大鼠脑损伤具有明显的改善作用,其机制可能与TFR作用于脑基底动脉,激活TRPV4通道,继而激活IKca与SKca通道,使内源性EDHF增多,导致平滑肌细胞产生内皮依赖性超极化,阻滞Ca~(2+)内流,促使脑基底动脉舒张有关。
【图文】：

阻断剂,细胞变性,脑组织病变,尼氏染色

图 4 TRPV4 等各阻断剂对 TFR 改善 CIR 大鼠大脑皮层病理学改变的影响（尼氏染色，×400 倍）Fig 4 Effects of various blockers such as TRPV4 on the pathological changes of cerebracortex in CIR rat induced by TFR (Nissl staining, × 400)A:Sham；B:CIR；C:TFR；D:TFR+HC-067047；E:TFR+Apamin；F: TFR+TRAM-. HE 染色观察大鼠脑组织病理学改变如图 5 所示，与 Sham 组相比，CIR 组大鼠脑组织细胞出现大量空泡，萎围间隙增大，神经纤维崩解以及小血管增生，并见有少量胶质细胞水肿。IR 组相比，TFR 组脑组织病变明显改善，但仍存在少量细胞变性；各联用阻组的脑组织细胞变性坏死仍较明显，但较 CIR 组有所改善。提示 TFR 对全血再灌注大鼠脑组织具有保护作用，且可能与 TRPV4、SKca 及 IKca 通道

阻断剂,舒张作用,大鼠,血管舒张作用

图 5 TRPV4 等各阻断剂对 TFR 改善 CIR 大鼠脑组织病理学改变的影响（HE 染色，×400 倍）Fig 5 Effects of various blockers such as TRPV4 on the pathological changes of cerebratissue in CIR rat induced by TFR (HE staining, × 400)：Sham；B：CIR；C：TFR；D：TFR+HC-067047；E：TFR+Apamin；F：TFR+TRAM. 动脉加压灌注法检测 CIR 大鼠 CBA 舒张作用的改变.1 TFR 对 CIR 大鼠 CBA 舒张作用的影响如表 5、图 6、图 7 所示，，在 PSS 液中加入 L-NAME(3×10-5mol/L)和 I10-5mol/L）预灌注 CIR 大鼠 CBA 30 min 后，加入 30 mmol/L KCl 使血管收定，再依次灌注含有 TFR（11~2700 mg/L）的 PSS 液。实验结果发现，在 NO 和 PGI2血管舒张作用的情况下，累加浓度的 TFR 仍能使 CBA 产生浓
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】