五没食子酰基葡萄糖对人胰腺癌细胞和携瘤鼠恶病质的治疗作用

发布时间：2020-05-04 05:47

【摘要】：研究目的:胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤,其恶性程度较高,是最致命的恶性肿瘤之一。由于胰腺癌早期诊断困难,手术切除率低,加之晚期胰腺癌对非手术的治疗手段反应较差,导致胰腺癌5年生存率不足1%。胰腺癌细胞主要通过对细胞内葡萄糖进行酵解而提供能量,在此过程中胰岛素和胰岛素样生长因子-1(IGF-1)发挥了重要作用。胰岛素和IGF-1不但与自己的受体,即IR和IGF1R,特异地相结合,还可以与彼此的受体交叉结合,从而促进胰腺癌细胞的生长。干扰胰岛素及其受体下游信号通路有可能对胰腺癌的发生发展起到调控作用。由于肿瘤细胞生长迅速,故瘤内常常处于相对缺氧状态,所以胰腺癌细胞可表达缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)并形成HIF-1。当肿瘤细胞高表达HIF-1α时,还可以激活下游的小窝蛋白(cav-1),使细胞的生长、糖酵解以及肿瘤的血管生成都会增加,这些因素都可以支持肿瘤细胞的快速生长。故HIF-1也是调节胰腺癌发生发展的一个重要靶点。此外,胰腺癌细胞即使在氧气充足的情况下依然会出现激活糖酵解关键酶(如:HK-Ⅱ和PFK-1)使糖酵解活性增强的现象,即“瓦博格效应”。瓦博格效应除了可以给肿瘤细胞供能,还能够促进肝脏糖异生(糖异生关键酶PCB和G-6-Pase活性增加)、刺激骨骼肌蛋白水解(代表肌肉降解的标志物Atrogin-1和Mu RF-1高表达)以及促进脂肪组织的脂解(脂解关键酶ATGL活性增强),最终因体重减轻、机体负氮平衡而导致癌恶病质的发生。抑制肿瘤细胞的瓦博格效应是治疗胰腺癌恶病质的潜在靶点。五没食子酰基葡萄糖(PGG)是一种存在于植物中的天然多酚化合物,PGG也是IR的配体,能够与IR/IGF1R结合,对细胞中葡萄糖的代谢起到重要的调节作用。PGG被证明在乳腺癌、前列腺癌、结肠癌和肝癌等诸多恶性肿瘤的治疗中均可发挥一定的抑制作用,其机制包括调节肿瘤细胞的细胞周期、调节HIF-1α的表达、调整细胞整体的营养代谢等途径。本研究的目的是探究β-PGG能否在胰腺癌细胞中通过抑制IR/IGF1R活性和HIF-1α的表达水平从而抑制该细胞的瓦博格效应并缓解胰腺癌荷瘤鼠的恶病质状态。研究方法:第一部分:1)应用胰腺癌细胞系MiaPaCa-2作为研究对象,使用不同浓度胰岛素(100 p M-1mM)刺激该细胞,在常氧和缺氧(1%氧)两种条件下进行实验。使用Western blot等方法检测常氧、缺氧条件下胰腺癌细胞IR和IGF1R的磷酸化程度、下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2信号通路的激活情况、HIF-1α和cav-1的变化情况及细胞糖酵解通路的关键酶HK-Ⅱ和PFK-1等指标,观察胰岛素对胰腺癌细胞的刺激作用。2)使用β-PGG(5、13、25、50mM)作用于MiaPaCa-2和PANC-1细胞,使用Western blot方法在常氧和缺氧两种条件下检测细胞中IR、IGF1R、Akt和ERK的磷酸化水平、HIF-1α和cav-1表达水平及细胞糖酵解通路的活性(HK-Ⅱ和PFK-1)等指标,观察β-PGG对上述信号通路的作用机制。3)使用β-PGG(25和50mM)作用于MiaPaCa-2细胞,随后使用MTT实验和集落形成实验检测了细胞短期和长期的增殖能力,使用迁移实验和划痕实验检测了细胞的迁移能力,观察β-PGG对胰腺癌细胞表型的影响。第二部分:用MiaPaCa-2细胞建立胰腺癌荷瘤鼠动物模型,40只裸鼠随机分为四组,每组10只,分别为对照组(intact athymic mice,I组),荷瘤组(untreated tumor carriers,U组)、PGG荷瘤给药组(treated withβ-PGG,P组)、大黄酸荷瘤给药组(treated with rhein,R组,作为阳性对照药物组)。除对照组外,其余三组的实验动物均在麻醉后采用二次成瘤的方法,在一侧腋窝皮下植入由MiaPaCa2细胞生成的肿瘤组织块(2 mm3),饲养1周后移植瘤生长良好,荷瘤鼠已经有明显的成瘤后开始给药治疗。P组携瘤鼠经灌胃给予β-PGG 20 mg/kg每日一次,R组给予大黄酸100 mg/kg每日一次,U组给予等体积的PBS每日一次,I组不处理。每周测量肿瘤的大小和记录体重。给药8周后,经麻醉将动物处死取材。利用肿瘤形态测量、组织学染色、血浆生化指标检测、骨骼肌、脂肪、肝脏代谢状态分析等研究方法,研究β-PGG的抗肿瘤能力及其对胰腺癌荷瘤鼠能量平衡的影响,分析肿瘤组织中IR和IGF1R的磷酸化程度、下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2信号通路的激活情况、HIF-1α和cav-1的变化情况及细胞糖酵解通路的活性(HK-Ⅱ和PFK-1)等。同时还将观察β-PGG对肝脏中PCB和G-6-Pase的水平的影响、对骨骼肌中Atrogin-1和Mu RF-1的水平的影响、对脂肪中ATGL的水平的影响来评价荷瘤鼠恶病质严重程度的改善情况。研究结果:体外实验研究结果:1)胰岛素作用于MiaPaCa-2细胞时,可以升高IR/IGF1R的磷酸化程度、激活下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路、上调HIF-1α和cav-1的表达、增强细胞糖酵解关键酶HK-Ⅱ和PFK-1的活性。2)β-PGG能够降低MiaPaCa-2细胞和PANC-1细胞中IR/IGF1R的磷酸化程度、抑制下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路的激活、抑制HIF-1α和cav-1的表达、降低细胞糖酵解关键酶HK-Ⅱ和PFK-1的活性。在细胞表型方面能够明显抑制MiaPaCa-2细胞的增殖和迁移能力。体内实验研究结果:3)β-PGG能够显著抑制胰腺癌荷瘤鼠体内肿瘤组织中IR/IGF1R的磷酸化程度、抑制下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路的激活、抑制HIF-1α和cav-1的表达、降低细胞糖酵解关键酶HK-Ⅱ和PFK-1的活性。还能明显缩小肿瘤的重量、体积和横截面积,促进肿瘤细胞的凋亡,明显抑制胰腺癌荷瘤鼠中瘤体的生长。4)β-PGG还能够降低胰腺癌荷瘤鼠肝脏中PCB和G-6-Pase的水平、减低骨骼肌中Atrogin-1和Mu RF-1的水平、抑制脂肪中ATGL的活性。研究结论:胰腺癌发生时,胰岛素可以通过激活受体的磷酸化、激活下游的PI3K-Akt和MEK-ERK1/2两条信号通路、上调HIF-1α和cav-1的表达等途径增强细胞糖酵解的活性和瓦博格效应,在一定程度上促进了胰腺癌的发生和发展。β-PGG能够显著抑制胰腺癌细胞内胰岛素受体及其下游信号通路的活性,明显抑制HIF-1α通路的激活和显著抑制癌细胞的瓦博格效应,抑制恶病质动物体内的肝糖异生、肌肉分解和脂肪水解程度。从而抑制胰腺癌肿瘤的生长,对肿瘤恶病质状态起到缓解作用,在一定程度上延缓了胰腺癌的病理进程。
【图文】：

细胞冻存,细胞计数,冻存,细胞

胞培养皿放置在显微镜下观察细胞的消化程消失、变圆，间隔逐渐变大，折光性增加，有已消化完成，此时迅速倒掉胰蛋白酶消化液血清的完全培养基。移液器吹打细胞表面数次（注意细胞平面各个从培养皿上完全脱落。按照实验要求留取一定其转移入新的细胞培养容器内，并保证细胞悬后放入 37°C 5 %CO2培养箱中继续培养和进：细胞按常规操作完成消化后，将消化好的含新的 EP 管中使用无菌 PBS 对细胞进行稀释（的细胞悬液，注入擦干净的盖有盖玻片的血细细胞计数板共进行两次计数（一共 8 个区域，上压线，右、下压线不算，见图 1.1）总数÷8×10（稀释倍数）×104= n 个/ml./ml×细胞原液总体积（5 ml）= 原培养瓶中的

胰岛素,胰岛素浓度,缺氧条件,氧浓度

素浓度在1-100nM之间时，胰岛素刺激MiaPaCa-2细胞中HIF-1α表达具有剂量依赖性，并且缺氧条件下MiaPaCa-2细胞中HIF-1α表达量均高于在相同浓度胰岛素作用下常氧条件下HIF-1α表达量（P均＜0.05，见图1.2）。实验结果表明：胰岛素确实能够刺激胰腺癌细胞中HIF-1α的表达。图1.2 胰岛素作用下MiaPaCa-2细胞中HIF-1α蛋白的表达情况（n=7，缺氧条件为1% 的氧浓度孵育6 h；图中胰岛素浓度：C,1, 2, 3, 4, 5分别代表0，0.1, 1, 10, 100,1000 nM，后图同；与不加胰岛素的对照组比较，*代表P＜0.05；与相同浓度胰岛素作用时常氧条件组相比较，#P＜0.05，##P＜0.01）。由于小窝蛋白-1（cav-1）是受HIF-1α调控的下游蛋白，所以我们又检测了使用不同浓度胰岛素刺激下，MiaPaCa-2细胞在常氧和缺氧两种条件下cav-1蛋白的表达水平。Western blot结果显示：在常氧条件下MiaPaCa-2细胞中cav-1表达量较低
【学位授予单位】：天津医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】