基于转录组测序技术研究五子衍宗丸对NTDs细胞模型凋亡途径的调控作用

发布时间：2020-05-04 21:54

【摘要】：目的:本研究以atRA诱导PC12细胞凋亡制备神经管畸形细胞模型,五子衍宗丸干预用药后检测细胞活力和凋亡情况,并运用RNA-seq技术对PC12细胞进行全基因组测序分析基因的表达情况。旨在探讨五子衍宗丸对神经管畸形细胞模型凋亡途径的调控及其作用机制。方法:将实验用PC12细胞随机分为4组:空白组(Control)、模型组(Model)、五子衍宗丸组(WYP),叶酸组(FA),每组3个复孔。造模前24h给予五子衍宗丸组125μg/mL,叶酸组给予100μg/mL叶酸。XTT法测定PC12细胞活力,Annexin V-FITC/PI双染法检测凋亡率,高通量RNA-seq测序技术对细胞总RNA测序,筛选差异表达基因,运用Venn图找出感兴趣的目的基因集。对目的基因集进行GO功能和KEGG通路显著性富集分析。运用WGCNA软件对五子衍宗丸干预的atRA诱导的PC12细胞凋亡机制相关基因进行共表达网络分析。结果:1.五子衍宗丸对atRA干预的PC12细胞活力的影响五子衍宗丸可增强atRA干预的PC12细胞活力,且效果优于叶酸。与空白组比,模型组细胞活力明显降低(P0.001);与模型组比,五子衍宗丸组细胞活力明显升高(P0.001);与模型组比,叶酸组细胞活力明显升高(P0.05)。2.五子衍宗丸对atRA干预的PC12细胞凋亡的影响五子衍宗丸可降低atRA干预的PC12细胞凋亡率,且效果优于叶酸。与空白组比,模型组细胞凋亡率明显升高(P0.001);与模型组比,五子衍宗丸组细胞凋亡率明显降低(P0.001);与模型组比,叶酸组细胞凋亡率明显降低(P0.01)。3.五子衍宗丸atRA干预的PC12细胞转录组测序差异基因表达分析3.1差异表达基因和目的基因集的确定及分析五子衍宗丸对atRA引起PC12细胞的大部分基因表达的上调或下调变化都有抑制作用。模型组比空白组有625个基因上调,五子衍宗丸组对其中390个基因有下调作用,而叶酸组只对其中62个基因有下调作用;模型组比空白组有1456个基因下调,五子衍宗丸组对其中1073个基因有上调作用,叶酸组对其中903个基因有上调作用。3.2目的基因集里凋亡通路中的基因五子衍宗丸相关的目的基因集有8个我们关注的rno04210凋亡(Apoptosis)通路中基因,分别是Birc5、Gadd45g、Gadd45b、Nfkbia、Pik3r1、Casp8、Casp12和Ern1。叶酸相关的目的基因集有3个rno04210凋亡(Apoptosis)通路中基因,分别是Casp12、Ern1、Birc5。3.3目的基因集GO分析五子衍宗丸相关目的基因集显著富集到3个我们关注的凋亡相关GO条目GO:0043523神经元凋亡过程的调节(regulation of neuron apoptotic process)、GO:0051402神经元凋亡过程(neuron apoptotic process)和GO:0070059内质网应激反应的内在凋亡信号通路(intrinsic apoptotic signaling pathway in response to endoplasmic reticulum stress)。3.4目的基因集KEGG分析五子衍宗丸相关目的基因集显著富集rno04110细胞周期(Cell cycle)、rno03030 DNA复制(DNA replication)和rno04141内质网蛋白质加工(Protein processing in endoplasmic reticulum)等可能与五子衍宗丸作用机制相关的KEGG通路。3.5五子衍宗丸对atRA诱导的PC12细胞凋亡机制相关基因共表达网络分析除了rno04210凋亡(Apoptosis)通路相关的基因外,五子衍宗丸抑制凋亡的机制还可能与Ttk、Sema6b、Mcm5等26个基因相关。结论:五子衍宗丸对atRA诱导的PC12细胞凋亡具有抑制作用,且效果优于叶酸。其抑制作用机制与五子衍宗丸广泛地抑制模型中基因的过度表达相关;与下调内质网应激反应相关的Ern1、Casp12基因介导的细胞凋亡途径相关;与下调凋亡相关基因Caspase家族成员Casp8相关;与上调凋亡抑制因子基因Birc5、生长停滞和DNA损伤基因Gadd45b、Gadd45g相关;与神经元凋亡过程相关;上调Pik3r1、Nfkbia基因,进而可能与PI3K/Akt信号通路、NF-κB信号通路相关;可能也与细胞周期、轴突导向、胆碱能突触、cAMP信号通路、内质网蛋白质加工通路及Ttk、Sema6b、Mcm5等26个共表达分析中连接度较高且与目的基因集里凋亡基因有共表达相关性的基因相关。
【图文】：

序列,转录组,数据处理流程,测序

基于转录组测序技术研究五子衍宗丸对 NTDs 细胞模型凋亡途径的调控作用振荡；掌上离心机稍离心；夹取 200μLEP 管于管架，将全部的液体转移到 200μLEP 管中，测浓度和纯度，标号置于-80℃保存。2.6 转录组测序及数据处理提取的样本的总 RNA 用 Illumina HiSeqTM2000 进行 RNA-seq，，得到每个样本的测序文件（*R1.fastq.gz，*R2.fastq.gz），用 Fastqc 查看原始序列数据质量，根据数据质量情况用 cutadapt 剪掉前 10bp 非正常数据，然后用 Trim_galore 清洗数据去掉低质量碱基及 adaptor 序列，再用 Fastqc 查看数据质量，没问题进行下一步。使用 STAR_2.6.4b 生成以大鼠基因组（UCSC rn6）为 GTF 注释文件的genome 索引文件，然后将处理后的 reads 进行与生成的 genome 比对生成*.BAM文件，使用 featureCounts 对 RNA-seq read（spaired-end）计算 counts 值，生成 counts文件。图 1 所示为转录组测序及数据处理流程图。

模型图,五子衍宗丸,样本,聚类

基于转录组测序技术研究五子衍宗丸3.3 五子衍宗丸 atRA 干预的 PC123.3.1 差异表达基因的确定为了对各样本聚类及基因的差异表edgeR 包作 MDS（Multidimentional sca型组（Model）、五子衍宗丸组（WYP）较为集中，说明各组的重复聚类性较好五子衍宗丸组和叶酸组的样本位置较为著。
【学位授予单位】：山西中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】