丹参酮ⅡA调控自噬保护ox-LDL诱导内皮细胞损伤的作用及其机制探讨

发布时间：2020-05-04 21:12

【摘要】：目的:通过建立氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导人脐静脉内皮细胞(EA.hy926)氧化应激损伤模型,观察丹参酮ⅡA调控PI3K/Akt/m TOR信号通路介导自噬对氧化应激损伤EA.hy926细胞的影响及其分子机制。材料与方法:第一部分:丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.Hy926自噬及时效关系探讨。1.采用MTT法分别观察不同浓度ox-LDL及丹参酮ⅡA对EA.Hy926细胞增殖的影响,筛选ox-LDL及丹参酮ⅡA干预EA.Hy926细胞的最佳浓度2.采用比色法检测细胞氧化应激损伤MDA含量及SOD活力,化学荧光探针法观察细胞氧化应激损伤ROS染色情况,探讨丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.hy926细胞氧化应激损伤的影响3.采用荧光免疫法细胞技术及Westernblot法检测细胞内MAP1-LC3蛋白不同时间点表达的变化观察丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导的EA.Hy926自噬效应的影响第二部分:丹参酮ⅡA调控PI3K/Akt/m TOR信号通路介导自噬对内皮细胞氧化应激损伤的保护作用研究选用PI3K/Akt/m TOR信号通路抑制剂LY294002,体外培养EA.hy926细胞,随机分为酮ⅡA组、LY294002组。用比色法检测细胞氧化应激损伤MDA含量及SOD活力,利用荧光免疫法及Naolive 3D cell explorer实时无标记3D显微成像系统检测自噬发生,同时应用Westernblot法检测自噬相关蛋白以及PI3K/Akt/m TOR通路蛋白的表达情况。基于PI3K/Akt/m TOR信号通路探讨丹参酮ⅡA调节自噬对ox-LDL诱导内皮细胞氧化应激损伤的保护作用及分子机制。结果:1.100μg/ml ox-LDL作用于EA.Hy926细胞24H造成明显氧化应激损伤,丹参酮ⅡA能减轻ox-LDL对EA.Hy926细胞产生的氧化应激损伤。免疫荧光法发现丹参酮ⅡA组LC3蛋白在6H,12H,24H形成较模型组增多,在12H表达最多。Westernblot法发现LC3蛋白表达水平在12H及24H明显增高,但在12H自噬效应蛋白LC3表达最为明显。2.与正常组相比,模型组MDA含量增高,SOD活力降低,LC3-II/I蛋白含量增多(P0.01);丹参酮ⅡA干预后细胞中MDA含量降低,SOD活力增高,LC3-II/I蛋白含量增多(P0.01)。加入PI3K的抑制剂LY294002后细胞中MDA含量增高,SOD活力降低,LC3-II/I蛋白含量降低。3.与正常组相比,模型组PI3K、P-Akt、P-m TOR、蛋白表达水平明显减少(P0.05或P0.01);与模型组相比,丹参酮ⅡA干预后细胞中PI3K、P-Akt、P-m TOR蛋白表达水平明显减少(P0.05或P0.01);与ox-LDL+丹参酮ⅡA组相比,加入PI3K的抑制剂LY294002后细胞中的PI3K、P-Akt、P-m TOR蛋白表达水平均明显降低(P0.05或P0.01)。结论:1、丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.hy926细胞活力下降、氧化应激增强等损伤反应具有明显抑制作用。2、丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.hy926氧化应激细胞模型的自噬活性有影响并存在时效关系。3、丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.hy926细胞自噬活性具有明显促进作用,且自噬活性增强是丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.hy926细胞损伤的保护作用机制之一。4、丹参酮ⅡA可能通过调控PI3K/Akt/m TOR信号通路促进自噬,对ox-LDL诱导的EA.Hy926细胞氧化应激损伤起到保护作用。
【图文】：

图 1 不同浓度的 ox-LDL 对 EA. hy926 细胞增殖 of different concentrations of ox-LDL on the proliferatiocellsμg/ml ox-LDL 对 EA. hy926 细胞 MDA 含量及 SOD

图 3 不同浓度的丹参酮 IIA 对 EA. hy926 细胞f different concentrations of tanshinone IIA on the phy926 cells参酮 IIA 对 ox-LDL 诱导 EA. hy926 细胞 ROS 染
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285

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本文编号：2649003