五种典型中药材中黄曲霉毒素的污染状况检测及赭曲霉毒素免疫试纸条的制备和简单应用

发布时间：2020-05-05 17:47

【摘要】：中药中常见的真菌毒素主要有黄曲霉毒素(aflatoxins,AFs)、赭曲霉毒素A(ochratoxin A,OTA)、伏马菌素(fumonisins,FBs)、T-2毒素等。其中AFs与OTA是中药中较易污染的真菌毒素两者都属于人类致癌物,严重威胁着用药安全性。因此,针对常见中药材中真菌毒素的定量化检测及防霉变控制技术的研究至关重要。本论文主要研究:1.IAC-HPLC-FLD方法测定5种典型中药饮片中黄曲霉毒素采用IAC-HPLC-FLD方法,样品经70%甲醇提取、免疫亲和柱净化后,利用液相色谱分离-荧光检测中药饮片中4种黄曲霉毒素(AFB_1,AFB_2,AFG_1和AFG_2)的含量。通过优化前处理方法,使得此方法能同时满足5种中药饮片远志、柏子仁、决明子、党参、薏苡仁的检测要求。收集并检测5种中药饮片114批次,其中26批柏子仁(AFs 1.22~46.67μg·kg~(-1),AFB_1 1.22~31.40μg·kg~(-1))、4批薏苡仁(AFs 1.97~41.13μg·kg~(-1),AFB_1 1.97~36.40μg·kg~(-1))、1批决明子(AFs 13.65μg·kg~(-1),AFB_1 12.60μg·kg~(-1))检出阳性、党参未检出、13批远志(AFs 2.40~194.46μg·kg~(-1),AFB_1 2.03~90.04μg·kg~(-1)),阳性率为41%,超标率为15%。2.远志初加工过程中黄曲霉毒素易发生关键环节的考察及脱除越来越多的研究报道出远志中黄曲霉毒素污染严重,但对其产生毒素的关键点及防霉变控制方面的研究较少。本章通过实地考察山西产地的远志的初加工过程,同时于实验室简单模拟远志产地初加工过程,包括埋土、发汗、抽芯等过程,检测在初加工的各个关键环节下黄曲霉毒素B_1,B_2,G_1,G_2的产生状况;并将由初加工得到的远志饮片在28℃,湿度范围为82%~90%和96%条件下分别进行储藏后一段时间后,测定毒素产生的情况,以此考察远志初加工-储藏过程中黄曲霉毒素的易污染环节。检测结果显示,远志在初加工各环节的样品检测结果均为阴性;其次2种湿度条件下储藏结果显示,当湿度为96%时,在7天的时间内远志发霉严重,并检测出了AFB_1、AFs的含量分别为4.01μg·kg~(-1),5.36μg·kg~(-1)。因此,将采收的远志鲜品进行及时处理和干燥,对远志真菌毒素污染的防控至关重要。以黄曲霉毒素含量高于限量(14号样品AFs,AFB_1分别为159.44,68.66μg·kg~(-1))与与低于限量(39号样品AFs,AFB_1分别为2.08,2.08μg·kg~(-1))的2个批次远志分别为进行黄曲霉毒素脱除研究。首先测定了在水洗及75%乙醇洗2种脱除方法下远志中黄曲霉毒素含量的变化,结果表明14号远志样品进行水洗和75%乙醇洗后对AFB_1的脱除率分别为92.47%和64.01%;39号样品在水洗和75%乙醇洗后,黄曲霉毒素未检出,对AFB_1的脱除率均为≤100%。其次测定了由饮片到颗粒剂的过程中毒素含量的变化,测得39号远志中AF_S和AFB_1,分别为60.61和11.97μg·kg~(-1),转移率分别为38.01%,17.43%;39号远志中未检出黄曲霉毒素,其转移率约为ND。3.柏子仁初加工过程中黄曲霉毒素易发生关键环节的考察及脱除中药柏子仁中毒素的脱毒是指采用物理、化学、生物等处理方法除去已受到污染的中药材表面或内部的毒素,中药在产地加工储藏中有效的监控将避免真菌毒素成为威胁人类健康的污染源。本章通过模拟柏子仁产地初加工过程,考察在不同初加工条件下各个关键环节下AFB_1,AFB_2,AFG_1,AFG_2的产生状况。结果表明模拟过程中的柏子仁未成品(处于初加工过程中某个环节的产品)未检出AFs,说明此加工过程不易被毒素污染。此外收集的隔年柏子仁未成品及柏子仁成品中AFs检测结果均超过限量,污染严重,说明药材基地在初加工的过程中,存在在得到柏子之前就已经被毒素污染或在储藏柏子的过程中被毒素污染这两种情况,更进一步说明了对中药加工初始环节监控的重要性。选取黄曲霉毒素毒素含量高于限量和低于限量的2个批次柏子仁样品(AFs,AFB_1毒素初始含量分别为23.95和23.17μg·kg~(-1)(1号样品);3.94和3.94μg·kg~(-1)(2号样品))进行进一步毒素脱除实验,测定在水洗及75%乙醇洗2种脱除方法下,比较被AFs污染的柏子仁中毒素含量的变化,得到1号样品进行水洗和75%乙醇洗后对AFB_1的脱除率分别为77.69%和≤100%,对AFs的脱除率分别为78.41%和≤100%;2号样品在水洗和75%乙醇洗后,2种脱除方式均无黄曲霉毒素检出,对AFB_1、AFs的脱除率均为≤100%。4.OTA免疫试纸条的制备及简单应用以胶体金标记抗体作为探针,通过优化金标抗体的偶联比、重悬液体系、C线与T线浓度等条件,自组装基于竞争法原理检测OTA的胶体金免疫试纸条。抗体加入量为5μg,10 mM PBS(1%蔗糖,0.02%MgSO_4,0.1%Tween 20)的重悬溶液体系下,采用NC140硝酸纤维素膜,肉眼检测限为2.5μg·mL~(-1),检测时间10~20 min。并采用70%甲醇-水提取收集的中药材样品,探讨胶体金试纸条在不同中药基质下的测定影响,检测方法满足欧盟限量标准15μg·kg~(-1)的要求。同时液质确证了免疫层析分析方法样品检测结果的准确性。
【图文】：

特异性抗体,免疫测定,金纳米颗粒,载体蛋白

稀释 3 倍，白芨经 60 %甲醇提取，稀释 4 倍，白芷以 70 %甲 4 倍可获得优异的检测灵敏度，为了克服基质、pH 干扰，获得准确的纸条应用于不同中药基质需采用适宜的样品制备方案。与 ELISA 法相测卡检测法更轻巧省功、方便携带，然而胶体金在试纸条上呈现的是淡景干扰掩蔽其颜色变化影响主观判断，且裸眼观测试纸条只能达到定性，无法满足定量检测需求，为了克服此类难题，研究者尝试通过改变标利用仪器辨别的方式等改善结果的灵敏度和准确度。武会娟等[38]开发了磁性免疫层析试剂盒（包括试纸条和超顺磁性复合粒子标记 AFB1抗体结合在超顺磁微粒上的目标物来定量检测生物样品中 AFB1水平。王艳料作为标记物，示踪待测物水平，该法检测限低至 0.1～0.3 ng·mL 1，.3～4 ng·mL 1。Urusov A E[40]采用二次标记抗体放大显色标记，实现该倍的目的（见图 1.1）。基于磁性复合粒子、金磁纳米以及二次放大模式度可达到 ELISA 水平，通过改善标记物能显著改善传统金纳米免疫层应对复杂基质中痕量检测的需求，放宽样品前处理制备条件，降低样品，尤其适合中药样品的检测，此类方法有望在中药 AFB1有待尝试。

色谱图,样品,混合对,薏苡仁

图 1.1 混合对照品溶液（A）、决明子阳性样品（B）、薏苡仁阳性样品（C）、党参阴性样品（D）、柏子仁阳性样品（E）、远志阳性样品（F）的 HPLC 图Fig. 1.1 Chromatograms of reference substances solution (A), cassia positive sample(B), coixseed positive sample (C), codonopsis negative sample(D), platycladi seed positive sample (E) 、Polygalae Radix positive sample (F)1.3.2 线性关系取 AFG2，AFG1，AFB2，AFB1混合对照品储备液，用甲醇-水（50：50）配制成一系列浓度的混合对照品溶液（AFG1，AFB1浓度：0.25，0.5，1，2.5，5，10，25 μg·L-1；AFG2，AFB2浓度：0.0625，0.125，，0.25，0.625，1.25，2.5，6.25 μg·L-1），分别进样 10 μL，记录色谱图，并记录浓度与峰面积的参数来绘制标准曲线，计算 4 组成分的回归方程分别为：y=50215 x+1435.1；y=23159 x+1424.6；y=81614 x+759.41；y=36325 x+192.24，其中 AFG2和 AFB2在 0.0625～6.25 μg·L-1范围内，AFG1和 AFB1在 0.25～25 μg·L-1范围内，线性相关系数 R2均大于 0.9996。1.3.3 精密度、重复性和稳定性试验精密称取供试品药材粉末(过 2 号筛)5 g，加入混合对照品溶液，按 2.2 项下方法制备
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284;O652

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