当归及其活性成分的抗抑郁作用及机制研究

发布时间：2020-05-07 05:46

【摘要】：选题依据:抑郁症是以持续情绪低落和认知功能障碍为主要临床特征,具有高患病率、高复发率、高致残率发病和高致死率等特点,其危害已越来越引起医药卫生界的重视。由于抑郁症的病因复杂且发病机制尚不明确,目前关于抑郁症的治疗仍未取得根本突破。因此,阐明抑郁症的发病机制和发现疗效确切的抗抑郁药物是医药工作者的首要任务。当归作为祖国传统医学“补血活血”要药,素有“十方九归”之美称,“药王”之美誉。相关研究表明当归在经典抗抑郁复方中使用频率高且占有重要地位,如逍遥散、无忧汤、当归芍药散、抑肝散等,且进一步研究表明单味药当归在慢性束缚应激模型、CUMS模型、和小鼠绝望模型也具有确切的抗抑郁作用。然而,这些报道仅观察了当归对抑郁症模型的抑郁症状的改善作用,并未关注当归对抑郁症模型血液系统的影响。此外,抑郁症模型是否存在血液系统紊乱的现象,当归抗抑郁作用机制又是什么,这些问题尚不明确。目前已有文献报道当归中部分化合物的抗抑郁活性,如:阿魏酸、香草酸、丁苯酞。然而,关于当归化学成分的抗抑郁活性仍无系统的研究报道。本研究将1)从当归单味药层面出发,明确当归对抑郁症模型的抑郁样症状和血液系统紊乱的改善作用,并明确两者间的的相关性和机制,不仅为当归药性理论的拓展提供科学依据,还将为抑郁症的临床治疗提供新的策略;2)从当归单体层面出发,系统地从当归中筛选具有抗抑郁作用活性成分,并对有效成分的作用机制进行探讨,为从中药当归中开发临床疗效确切、质量可控的抗抑郁天然产物奠定药理学基础。目的:(1)明确当归对抑郁症模型的抑郁样症状和血液系统紊乱的改善作用;并从代谢组学和分子生物学角度阐明当归抗抑郁作用与调节血液系统间的相关性及机制;(2)从当归中系统筛选具有抗抑郁作用的天然小分子化合物;(3)验证主要活性成分阿魏酸松柏酯体内抗抑郁活性进行,并阐释其作用机制。方法:(1)采用孤养结合CUMS抑郁模型,以体重、糖水偏爱率、水平穿越格数、直立次数以及强迫游泳不动时间为指标,明确当归对CUMS模型抑郁样症状的改善作用;再以外周血象、血气、以及血流变为指标,明确当归对CUMS模型大鼠血液系统紊乱的改善作用,并对当归的抗抑郁作用与调节血液系统功能进行相关性分析;以血清和肝脏(贮藏血液的器官)生物样本为研究对象,采用UPLC-MS/MS和NMR代谢组学技术,分析当归对差异代谢物和代谢通路的调节作用,进而阐明当归的抗抑郁作用及其与调节血液系统间的相关性机制;最后采用Western blotting技术检测当归对CUMS大鼠肝脏中的HIF-1α、PDK-1和LDHA的蛋白表达量的影响,明确HIF-1α介导的能量代谢途径在当归通过养血发挥解郁功效中的重要作用。(2)采用超临界CO_2技术萃取获得当归提取物,运用多种色谱分离方法对当归提取物进行分离获得单体成分,通过波谱解析(NMR、MS)对得到的单体化合物进行结构鉴定;再结合文献报道从市场上购买已知的当归的化学成分。通过以上两种方式获得当归的单体成分,为当归抗抑郁活性化合物的筛选奠定物质基础。再分别采用皮质酮、谷氨酸、和H_2O_2损伤的PC12细胞模型,以细胞存活率为指标,对所获得的单体化合物进行抗抑郁活性筛选;最后运用神经递质转运体抑制剂高通量筛选模型对所获得的单体化合物进行抗抑郁活性筛选。(3)采用小鼠悬尾试验和小鼠强迫游泳实验对主要活性成分阿魏酸松柏酯的体内抗抑郁药效进行验证;采用MTT法和LDH释放法检测阿魏酸松柏酯对谷氨酸损伤的PC12细胞的保护作用;采用流式细胞术检测细胞凋亡率、线粒体膜电位(MMPs)、细胞内Ca~(2+)浓度和活性氧(ROS);采用试剂盒法测定SOD活性和丙二醛(MDA)水平;采用Western blot技术检测p-NR2B、p-CaMK II、p-JNK、p-p38、细胞色素C、Bax、Bcl-2、caspase-3水平。结果:(1)7.5 g生药/kg和15 g生药/kg的当归能显著逆转CUMS引起的大鼠体重、糖水偏爱率、穿越格数和直立次数显著性降低,强迫游泳不动时间显著性升高。慢性不可预知刺激大鼠28天能使SD大鼠出现平均红细胞体积(MCV)、单核细胞百分比(MO%)、血氧分压(PO_2)、血氧饱和度(sO_2)、pH显著性降低,红细胞计数(RBC)、血小板计数(PLT)、红细胞分布宽度(RDW)、二氧化碳分压(PCO_2)和全血粘度显著升高的现象,当归能在一定程度上逆转CUMS引起的血液系统紊乱。进一步研究结果表明,行为学综合指标与血液系统综合指标的相关系数较高,当归的抗抑郁作用与其养血功效具有较高的相关性。代谢组学研究结果显示,与空白组相比,CUMS抑郁模型大鼠血清中的40个生物标志物和肝脏中的47个生物标志物均发生了显著性变化,给予当归干预后,血清中的26个和肝脏中的27个差异代谢物被显著性回调。此外,当归还能抑制CUMS抑郁大鼠的HIF-1α、PDK-1和LDHA的过表达。(2)从当归药材中分离得到12个单体化合物,其中包括Z-丁烯基苯酞(1)、藁本内酯(2)、E-丁烯基苯酞(3)、棕榈酸(4)、cis-Z,Z'-3a.7a',7a.3a'-dihydroxyligustilide(5)、Tokinolide A(6)、Tokinolide C(7)、β-谷甾醇(8)、Riligustilide(9)、12-异戊烯酰基-14-乙酰基-2E,8E,10E-三烯-4,6-二炔-1-醇(10)、法卡林二醇(11)、阿魏酸松柏酯(12)。Tokinolide C是未经文献报道的新化合物。从市场上购买到的当归中的化合物11个,其中包括洋川芎内酯A(13)、洋川芎内酯H(14)、洋川芎内酯I(15)、新蛇床内酯(16)、欧当归内酯A(17)、阿魏酸(18)、5-羟甲基糠醛(19)、欧前胡素(20)、香草酸(21)、伞形花内酯(22)、正丁基苯酞(23)。体外实验研究表明,洋川芎内酯A和阿魏酸对皮质酮损伤的PC12细胞具有明显的保护作用;藁本内酯、Z-丁烯基苯酞、阿魏酸松柏酯和Tokinolide A对谷氨酸损伤的PC12细胞具有明显的保护作用;洋川芎内酯A、洋川芎内酯I和正丁基苯酞对H_2O_2损伤的PC12细胞具有明显的保护作用。此外,5-羟甲基糠醛和阿魏酸松柏酯对ASP+有明显的抑制作用。(3)阿魏酸松柏酯能显著性缩短TST、FST的小鼠不动时间;抑制谷氨酸诱导的PC12细胞存活率下降、LDH释放、细胞凋亡率升高;抑制谷氨酸诱导的PC12细胞Ca~(2+)内流、p-NR2B、p-CaMK II、p-JNK、p-p38水平升高;抑制谷氨酸诱导的PC12细胞ROS生成,SOD活性降低,MDA水平升高;抑制谷氨酸诱导的PC12细胞MMPs下降,Bcl-2/Bax介导的线粒体凋亡通路的激活。结论:(1)当归能有效改善CUMS模型大鼠的抑郁样症状和血液系统紊乱现象。当归的抗抑郁作用与其调节血液系统功能密切相关,其机制可能能涉及TCA循环、糖代谢、氨基酸代谢、鞘脂代谢、甘油脂代谢、牛磺酸代谢、和脂类代谢。HIF-1α信号通路介导的能量代谢途径是当归通过养血发挥解郁作用的重要途径之一。(2)洋川芎内酯A、阿魏酸、藁本内酯、Z-丁烯基苯酞、阿魏酸松柏酯、Tokinolide A、洋川芎内酯I、正丁基苯酞和5-羟甲基糠醛可能是当归抗抑郁药效物质基础。(3)阿魏酸松柏酯在体内外均表现出较好的抗抑郁作用,其机制与调节NMDAR-CaMKII-MAPKs信号通路、抗氧化应激和抗线粒体凋亡有关。
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解郁,养血,抗抑郁作用,科学内涵

图 1 当归及其活性成分的抗抑郁作用机制和其在抗抑郁复方中的贡献Fig. 1Antidepressant mechanismof Radix Angelica sinensis and its active ingredients, and itscontribution to the compound prescription3 浅谈“养血解郁”的科学内涵抑郁症患者不仅伴有心境低落、思维迟缓、意志活动减退等临床症状，还存在心悸、胸闷、闭经等躯体症状，表明抑郁症常伴有心血不足、气血不畅、心脉瘀阻等病征[66]。相关研究还表明抑郁症常常并发贫血[67]和心血管疾病[68]。因此，抑郁症与血液系统功能紊乱存在着密切的联系。本文从中医理论指导和现代科学研究的角度出发，综述了抑郁症与血液系统功能紊乱之间的联系，进而提出“养血解郁”理论，为抑郁症的临床治疗提供新的策略。3.1 中医理论指导3.1.1 郁症与血液系统功能紊乱夫郁者，闭结、凝滞、瘀蓄、抑遏之总名也[69]。郁症大多由于七情所伤，，情志

当归,糖水,大鼠

图 2.1 当归对 CUMS 大鼠体重的影响re 2.1 Effect of CUMS on rats and therapeutic effect of Radix Angelicae Sinensis in body当归对 CUMS 大鼠糖水偏爱率的影响验各组大鼠糖水偏爱率统计分析结果如表 2.2 所示。造模前，各组大鼠显著性差异。造模第 21 天时，与空白组相比，CUMS 组大鼠糖水偏爱p＜0.01），说明模型组大鼠出现了快感缺失的症状。与模型组相比，著性升高，当归低剂量组与模型组具有显著性差异（p＜0.05），文拉法剂量组、逍遥散组与模型组具有极显著性差异（p＜0.01）。于造模 28组相比，各给药组均具有极显著性差异（p＜0.01）。表 2.2 当归对 CUMS 大鼠糖水偏爱率的影响（ x±s, n=12）le 2.2 Effect of CUMS on rats and therapeutic effect of Radix Angelicae Sinensis in the spreference test组别测试时间
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】