莪术二酮抑制凝血酶诱导血小板活化的蛋白组学研究

发布时间：2020-05-08 08:09

【摘要】：血栓是血液成分在血管或者心脏内膜表面形成的血液凝块或沉积物,可以发生在血液中的任何地方导致血液流动停止。在生理情况下,当内皮细胞血管壁受到损伤后,血小板随之附着,导致血小板激活,引起血小板聚集,可发挥止血作用并且修复损伤部位。然而,在病理情况下,血小板发生不正常的或过度的活化可能会在损伤的部位过度聚集进行形成血栓成为心脑血管疾病的发病基础。由此可见,血栓的形成与血小板活化和聚集密切相关。现代研究发现,从温郁金中提取的莪术二酮具有显著的抗凝血,抗血栓形成的作用。当给予四种诱导剂刺激血小板活化时,发现莪术二酮对于凝血酶诱导的血小板活化具有显著的抑制作用,那么莪术二酮抑制血小板激活的作用靶点是什么呢?蛋白质组学作为一种高通量筛选技术,已经在寻找药物对疾病的靶点蛋白,比较蛋白功能水平上被广泛应用,而由于血小板无核,病人血小板功能的异常几乎完全归因于蛋白表达的变化翻译后修饰的动态差异,而血小板的蛋白组学只需要少量毫升的血液就能揭示蛋白质的翻译后修饰以及蛋白间的相互作用,而非标记定量主要是对酶解后的肽段进行质谱分析比较从而对蛋白进行相对定量,于是课题组采用了非标记定量的蛋白组学方法进行了莪术二酮对凝血酶诱导的血小板激活的抑制作用可能机制的探讨。本研究实验内容如下:目的:本研究主要观察莪术二酮作用于血小板后蛋白表达谱的改变情况,探讨莪术二酮抑制血小板活化的可能机制,并找到具体的作用靶点来解释作用机制。方法:首先采用透射电镜实验观察莪术二酮对凝血酶诱导的人血小板活化的抑制作用,抽取健康志愿者血小板,洗涤后,分为生理盐水组,凝血酶诱导组以及莪术二酮孵育组,数步处理后观察不同组别的血小板内α颗粒的释放情况。为进一步阐明莪术二酮抑制凝血酶诱导的血小板聚集的作用机制,本实验建立了三组血小板蛋白的液质分析总离子流图谱,将Nano ESI-LC-MS/MS得到的数据用Sequest HT引擎搜库,利用Proteome Discoverer 1.3软件鉴别各组血小板总蛋白,采用Uni Prot分析软件分析蛋白。鉴别后的蛋白利用Chrom Align软件整合,使用SIEVE1.3软件鉴别不同组之间的差异蛋白。使用IPA和PANTHER等生物信息学方法搜索差异蛋白之间的互作网络以及参与的信号通路。利用Western blotting方法验证蛋白组学结果以及添加抑制剂来验证可能的信号通路与作用靶点。结果:透射电镜实验结果显示100μM莪术二酮能够明显抑制0.3 U凝血酶引起的血小板内α颗粒的释放。蛋白组学结果发现,与生理盐水组相比,凝血酶组有22个差异蛋白,其中有8个蛋白上调,14个蛋白下调。与凝血酶组相比,莪术二酮组有两个差异蛋白,Talin1和β1-tubulin在莪术二酮处理后显著下调。生物信息学结果提示差异表达蛋白质与细胞进程,生物粘附以及生物发展有关,主要参与了整合素信号通路。Western blotting验证差异蛋白表达水平与蛋白组学结果相同。抑制β1-tubulin的表达能够抑制vinculin/talin1的蛋白表达水平,同时能够抑制血小板内α颗粒的释放。结论:莪术二酮主要是通过调节β1-tubulin的表达调控vinculin/talin1介导的整合信号通路从而抑制血小板活化;β1-tubulin可能是莪术二酮抑制凝血酶诱导的血小板活化的具体作用靶点。
【图文】：

图 1 莪术二酮化学结构图Fig 1. Chemical structure of curdione主要是从 DNA 到 mRNA 再到蛋白质，存在转录水平调控，在 mRNA 层面存在水平调控。然而蛋白质层面的调控不单能全面反应蛋白质表达水平。有实验证关性并不好，特别是对于低丰度蛋白质、蛋白质复杂的翻译后修饰以及亚细胞根据 mRNA 水平来判断。蛋白质是生命相互作用以及蛋白质构象等蛋白质本身蛋白质来解决。于是蛋白质组学应运而找药物对疾病的靶点蛋白，比较蛋白功

3 结果和讨论3.1 莪术二酮对 α-颗粒释放的抑制作用研究表明，血小板胞内主要存在两种颗粒：α 颗粒和致密颗粒。血小板活化时释放的 α 颗粒，颗粒中包含 P-选择素、生长因子、凝血因子和趋化因子等多种分子，参与了血小板聚集过程。为了探究凝血酶作用血小板后 α 颗粒的释放变化，实验采用透射电子显微镜的方法从血小板形态学上进行观察，根据课题组前期研究结果[14]，我们选取了 0.3 U 凝血酶和 100 μM 莪术二酮作用于血小板，以期得到莪术二酮抑制血小板活化的能力。在生理盐水组中，大部分地颗粒内容物存在于血小板中，如图 2 所示，与加入 NS 组相比（如图 2A），在血小板中加入 0.3 U 凝血酶作用下血小板的 α 颗粒几乎完全释放（如图 2B）。提前孵育 100 μM 莪术二酮再加入凝血酶诱导后则几乎完全抑制了凝血酶作用的 α 颗粒的释放（如图 2C）。血小板超微结构的观察提示莪术二酮能够抑制凝血酶诱导的血小板活化。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：2654384