愈肝龙抗肝纤维化药效学及作用机制研究

发布时间：2020-05-10 21:25

【摘要】：背景:肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化、肝细胞癌发展的一个动态过程,若发生早期不给予积极有效的治疗,一旦发展成为肝硬化甚至肝坏死阶段,治疗将更加困难。肝纤维化是肝脏内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)过度沉积的结果,已知肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSCs)的活化是形成ECM的主要原因,很多因子均参与了HSCs的活化,其中影响最强烈的为直接激活HSCs产生ECM的转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)和促进HSCs增殖、迁移的血小板衍生生长因子-BB(platelet-derived growth factor-BB,PDGF-BB)。肝纤维化是一个多种细胞因子多种信号通路共同介导的复杂的慢性疾病,探究肝纤维化的发病机制,开发有效逆转肝纤维化的药物具有重要的临床价值。近年来,我国的中医药在抗肝纤维化防治中发挥重要作用,愈肝龙(Yu Gan Long,YGL)作为一种传统的纯中草药复方,多年来,在临床上被用于治疗急慢性肝炎、初期肝硬化和肝纤维化等肝脏疾病,然而因其抗肝纤维化作用机制至今仍不明确,一直未能广泛推广应用。目的:本文旨在通过运用四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl_4)建立大鼠肝纤维化模型,初步明确愈肝龙减轻肝纤维化的药效及其作用机制,为其进一步推广使用提供科学依据。方法:将40%的CCl_4溶液(四氯化碳:橄榄油=2:3)皮下注射Sprague Dawley(SD)大鼠诱导肝纤维化模型,四氯化碳溶液首剂量为5 kg/m L,第二次开始剂量为3 kg/m L,每周2次,共持续8周,Control组给予等体积橄榄油溶液。第9周至第20周,除每周2次四氯化碳造模外,愈肝龙各给药组每天灌胃相应剂量的愈肝龙浸膏;干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)组每天皮下注射IFN-γ;Control组大鼠灌胃等体积的生理盐水,每天灌胃1次,一共12周。实验期满,取出所有大鼠的血清、肝脏、脾脏、肾脏、肺和胸腺,计算脏器系数。生化试剂盒检测大鼠血清中ALT、AST、TBIL的含量;酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测大鼠血清中四型胶原蛋白(collagen Ⅳ,Col Ⅳ)、三型前胶原蛋白(type Ⅲ precollagen,PC Ⅲ)、透明质酸(hyaluronuc acid,HA)、层黏蛋白(laminin,LN)、TGF-β1、PDGF-BB、肿瘤坏死因子-a(tumor necrosis factor-a,TNF-a)、IL-1b、IL-6、IL-4、IL-17A和IFN-γ的含量;苏木精-伊红(hematoxylin-eosin,HE)染色和马森(Masson)染色用来判断肝脏组织的病理生理结构变化;免疫组化染色检测大鼠肝脏中α-平滑肌肌动蛋白(a-smooth muscle actin,α-SMA)、TGF-β1、基质金属蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP-2)、p-STAT3、p-AKT和p-ERK1/2的表达;Western blot检测大鼠肝脏中基质金属蛋白酶抑制剂-1(tissue inhibitor of metalloproteinases-1,TIMP-1)、MMP9、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、Smad4、Smad7、JAK1、p-JAK1、STAT3、p-STAT3、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT、Ras、Raf-1、p-Raf-1、ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38和p-p38蛋白的表达。结果:与Control组比较,ALT、AST和TBIL的含量在CCl_4组显著升高(p0.01),与CCl_4组相比,0.5 g/kg YGL和1.0 g/kg YGL明显降低肝纤维化大鼠血清中ALT、AST和TBIL的含量(p0.05或p0.01);与Control组比较,Col Ⅳ、PC Ⅲ、HA和LN的含量在CCl_4组显著升高(p0.01),与CCl_4组相比,Col Ⅳ、HA和LN的含量在0.25 g/kg YGL、0.5 g/kg YGL和1.0 g/kg YGL组明显降低(p0.05或p0.01),PC Ⅲ含量在1.0 g/kg YGL组显著降低(p0.01);HE结果显示,Control组的肝脏结构相对正常,各种纤维细胞排列比较整齐,而CCl_4组肝细胞出现水肿现象,且伴随有脂肪变性,肝小叶结构破坏或消失,愈肝龙灌胃后,各剂量组肝脏的病变程度均有不同程度的改善;Masson染色结果显示CCl_4致肝脏组织中胶原的广泛积累,与CCl_4组相比,愈肝龙灌胃后,各剂量组的肝脏组织胶原沉积均有降低;肝脏组织中α-SMA和TIMP1的表达在愈肝龙灌胃后降低,而MMP2和MMP9的表达升高;各剂量组愈肝龙灌胃后,大鼠血清和肝脏中TGF-β1的表达与CCl_4组相比均有所减少;与CCl_4组相比,肝纤维化大鼠肝脏中与TGF-β1/Smad信号通路相关的p-Smad2、p-Smad3和Smad4的表达有所下调,Smad7的表达有所上调;愈肝龙下调肝纤维化大鼠血清中PDGF-BB的表达,下调肝脏中由PDGF-BB介导的Ras、p-Raf-1、p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、p-PI3K、p-AKT、p-JAK1和p-STAT3蛋白的表达;此外,愈肝龙下调肝纤维化大鼠血清中的TNF-a、IL-1b、IL-6、IL-4和IL-17A的含量,上调IFN-γ的含量;愈肝龙下调肝纤维化大鼠肝脏内转录因子ROR-γt和GATA3的表达,上调T-bet的表达。结论:1、愈肝龙通过调控肝纤维化大鼠肝脏组织TIMPs和MMPs的平衡促进ECM的降解;2、愈肝龙通过调控TGF-β1/Smad、JAK1/STAT3、PI3K/AKT和Ras/ERK信号达到抗肝纤维的作用;3、愈肝龙通过调节肝脏组织Th1、Th2和Th17细胞的平衡进而减轻CCl_4诱导的肝纤维化。本研究明确了愈肝龙抗肝纤维化的药效,初步阐明了其抗肝纤维的作用机制。
【图文】：

肝脏,主要脏器,脏器系数

图 1 愈肝龙对肝纤维化大鼠肝脏外观的影响。Fig.1. YGL influences the appearance of liver tissues.3.3 愈肝龙对肝纤维化大鼠主要脏器的脏器系数的影响

脏器系数,主要脏器,平均数,肾脏

图 2 愈肝龙对肝纤维化大鼠主要脏器的脏器系数影响。（A-E）肝脏、肾脏、脏、肺、胸腺的脏器系数。数据用平均数±标准偏差表示，，▲p<0.05 和▲▲p<0.01 Control 组；#p<0.05 和##p<0.01 vs CCl4组。Fig.2. YGL influences the organ coefficient of the main organs in liver fibrosis ra
【学位授予单位】：湖北中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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