薯蓣皂苷元诱导人多发性骨髓瘤RPMI8226细胞凋亡机制的研究

发布时间：2020-05-11 08:27

【摘要】：多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一种由于浆细胞的克隆性增生所造成的造血系统肿瘤,好发于中老年人,多数患者出现肾功能不全、骨病变、贫血、免疫缺陷等临床症状。MM发病率居于血液系统恶性肿瘤的第二位,其发病机制尚不清楚。肿瘤的发生与细胞增殖凋亡失衡的关系密切,细胞凋亡途径主要有线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径3条通路。诱导细胞凋亡,也是抗肿瘤药物重要作用机制之一。临床治疗MM的方法主要是通过化疗和自体造血干细胞移植,来改善患者的临床症状,减缓疾病的进展。近年来,新型的靶向药物已经被逐渐应用于MM的临床治疗中,虽然取得了良好的治疗效果,但是仍然不能避免产生耐药性和复发,并且化疗产生的毒副作用严重影响了患者的生活质量,因此新药物研发仍然具有重要意义。薯蓣皂苷元(Diosgenin,Dio)是在薯蓣科植物中分离得到的甾体皂苷元,是多种甾体类激素的生产原料。目前,药理学研究表明,Dio在扩张血管、免疫调节、降低血脂、抑制肿瘤增殖等方面有重要作用,尤其是抗肿瘤作用越来越受到关注。研究表明,Dio的抗肿瘤作用广泛,能够抑制人宫颈癌Hela细胞、黑色素瘤A375-S细胞、人慢性粒细胞性白血病K562细胞在内的多种肿瘤细胞生长,并诱导其凋亡,此外Dio诱导肿瘤细胞凋亡涉及了Fas/Fas L、细胞色素C、p53、Caspase、NF-κB等多种信号因子,但是Dio是否对MM细胞也具有抑制作用,目前还尚未见有文献报道。因此本课题拟以多发性骨髓瘤RPMI8226细胞为研究对象,观察Dio对其是否有诱导凋亡作用并探讨其作用机制。目的:观察Dio对RPMI8226细胞凋亡的影响,探讨Dio诱导RPMI8226细胞凋亡的作用机制,为Dio的开发应用提供实验依据。方法:采用CCK8法检测不同浓度、不同作用时间的Dio对于RPMI8226细胞增殖的影响,并筛选药物有效的抑制浓度;以10nmol/L硼替佐米(Bortezomib,BTZ)为阳性对照组,采用流式细胞技术检测不同浓度Dio作用于RPMI8226细胞后凋亡情况的变化;采用RT-PCR方法检测不同浓度Dio作用于RPMI8226细胞后Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、细胞色素C(Cytochrome C,Cyt-C)m RNA表达水平的变化;采用Western Blot方法检测不同浓度Dio作用于RPMI8226细胞后Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C蛋白表达水平的变化;数据均采用SPSS 19.0软件包进行分析。结果:1 CCK-8检测Dio对RPMI8226细胞的增殖抑制率1.1 RPMI8226细胞在Dio作用下培养24h后,与空白组相比,Dio药物组细胞出现一定抑制作用(P0.05),5、10、20、30、40、50μmol/L Dio药物组抑制率分别为4.96%、11.95%、24.09%、36.59%、41.76%、48.96%。1.2 RPMI8226细胞在Dio作用下培养48h后,与空白组相比,Dio药物组出现一定的抑制作用(P0.05),5、10、20、30、40、50μmol/L Dio药物组抑制率分别为6.42%、11.27%、26.02%、49.29%、67.04%、86.50%。CCK-8细胞增殖实验结果显示,Dio对RPMI8226细胞增殖有一定的抑制作用,并且具有时间剂量依赖性。根据Dio对RPMI8226细胞的抑制率,所选择3个Dio剂量分别是10、20、30μmol/L。2流式细胞仪检测RPMI8226细胞的凋亡率与空白组相比,BTZ组RPMI8226细胞凋亡比率升高(P0.05),10μmol/L Dio组、20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组细胞凋亡比率比空白组升高(P0.05),具有剂量依赖性。20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组凋亡比率比BTZ组升高(P0.05),具有剂量依赖性。3实时荧光定量PCR法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cty-C m RNA的表达情况与空白组相比,BTZ组Bax/Bcl-2、Caspase-9、Cty-C m RNA表达比空白组上调(P0.05),Caspase-3 m RNA无明显变化(P0.05);10μmol/L Dio组、20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组Bax/Bcl-2、Cty-C m RNA表达较空白组上调(P0.05),具有剂量依赖性;20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组Caspase-3、Caspase-9 m RNA明显升高(P0.05),具有剂量依赖性。与BTZ组相比,10μmol/L Dio组、20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组Caspase-3 m RNA均升高(P0.05),具有剂量依赖性;20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组Caspase-9 m RNA表达比BTZ组上升(P0.05),具有剂量依赖性;10μmol/L Dio组、20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组Cty-C m RNA与BTZ组相比,差异没有统计学意义(P0.05)。BTZ组Bax/Bcl-2上调比10μmol/L Dio组、20μmol/L Dio组、30μmol/L Dio组更明显,差异具有统计学意义(P0.05)。4.Western Blot法检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C蛋白的表达情况与空白组相比,BTZ组Bax/Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9、Cyt-C蛋白表达升高(P0.05);10μmol/L Dio组、20μmol/L Dio组、30μmol/L Dio组Bax/Bcl-2、Caspase-3、Cyt-C蛋白表达比空白组升高(P0.05),有剂量依赖性;30μmol/L Dio组Caspase-9蛋白比空白组上调(P0.05),有剂量依赖性。20μmol/L Dio组和30μmol/L Dio组Bax/Bcl-2、Caspase-3的表达比BTZ组上调(P0.05),有剂量依赖性;30μmol/L Dio组Caspase-9、Cyt-C的蛋白表达量比BTZ组上调(P0.05),有剂量依赖性。结论:1.薯蓣皂苷元对多发性骨髓瘤RPMI8226细胞增殖有抑制作用,并可以诱导其凋亡。2.薯蓣皂苷元可能通过激活线粒体介导的内源性凋亡通路,以Caspase依赖的方式诱导RPMI8226细胞凋亡。
【学位授予单位】：承德医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】