大黄及其总蒽醌肝肾毒性研究

发布时间：2020-05-12 14:34

【摘要】：大黄(Rhei Radix et Rhizoma)是一味常用中药,是蓼科植物唐古特大黄Rheum tanguticum Maxim.ex Balf.、药用大黄Rheum offcinale Baill.以及掌叶大黄Rheum palmatum L.的干燥根茎及根,具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经及利湿退黄等作用,临床用于实热积滞便秘,血热吐衄,目赤咽肿,痈肿疔疮,肠痈腹痛,瘀血经闭,产后瘀阻,跌打损伤,湿热痢疾,黄疸尿赤,淋证,水肿,外治烧烫伤[1]。大黄主要成分为蒽醌类,包括大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚等,除此之外还有苯丁酮苷类、鞣质、挥发油、多糖、脂肪酸、蛋白质等[2]成分。大黄性味苦寒,泻下之力迅猛,若使用不当,可能造成不良反应[3]。以往关于大黄及其主要成分蒽醌类的毒性研究已有报告,结论有一定差异,在多认为蒽醌类在一定剂量下可能造成肝肾毒性。但是以往对大黄及蒽醌的肝肾毒性机制研究较少。本研究拟在重复大黄及其总蒽醌的毒理学研究的基础上,重点通过大黄对肝脏与肾脏转运子表达的影响,初步探讨其毒性机制。根据以往研究,大黄提取物的毒性剂量范围在10～12 g/kg,大黄总蒽醌的毒性剂量范围在135 mg/kg～4500mg/kg。本研究第一部分将参考此毒性剂量范围设计实验剂量,重复大黄提取物及总蒽醌的肝肾毒性研究。肝脏和肾脏分别是人体的代谢及排泄器官,在体内内源性物质以及外源性物质包括药物的代谢和转运过程中起着非常重要的作用。本研究第二部分将主要观察大黄及其总蒽醌对肝肾相关转运子表达的影响,以初步探讨其肝肾毒性机制。目的:观察不同剂量下大黄提取物及总蒽醌的肝肾毒性,了解毒性剂量范围;通过对肝肾相关转运子mRNA的分析,探讨大黄提取物及总蒽醌肝肾毒性机制。方法:健康SPF级SD大鼠80只,雌雄各半。按体重随机分为对照组A、大黄提取物不同剂量组(2、8、16 g生药/kg,分别相当于临床剂量的1.25、5、10倍);对照组B、大黄总蒽醌不同剂量组(0.5、2.5、5 g药粉/kg)。每组10只动物,雌雄各5只。大黄提取物不同剂量组均采用灌胃给药,每日一次,连续给药1个月。对照组A与大黄不同剂量组平行进行试验,给予等体积的纯净水。大黄总蒽醌不同剂量组灌胃给药10天,每日一次,连续给药10天。对照组B与大黄总蒽醌平行进行试验,给予等体积的纯净水。末次给药结束后,采用代谢笼收集16h尿液,测量尿量,采用尿液分析仪进行尿定性指标检测(尿蛋白、尿糖、尿胆原、红细胞、白细胞等);采用ELISA方法测定尿液NGAL(Neutrophil gelatinase-associated lipocalin)、KIM-1(Kidney injure molecule-1)含量。将动物麻醉后经腹主动脉取血,分离血清,分析ALT、AST、BUN、CRE等血清生化指标及血象指标。摘取肝脏和肾脏,将部分肝、肾组织常规用甲醛固定、取材、脱水、石蜡包埋、切片、苏木素-伊红染色,显微镜下进行病理检查。另外部分的肾脏组织分装入去RNA酶的试管中,放入液氮速冻后放入-80℃C留存,用于后续RT-PCR试验,分析肾脏的肾脏有机阴离子转运体(OAT1、OAT3)、中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白(NGAL)、丛集素(Clusterin)mRNA表达水平。另取动物分成对照组和大黄总蒽醌5 g/kg剂量组,进行对氨基马尿酸(PAH)清除率检测实验。大鼠灌胃给予大黄总蒽醌5 g/kg 10天后,腹腔注射10%水合氯醛麻醉(350 mg/kg大鼠)。在无菌条件下行颈总静脉插管和股静脉插管术。将手术成功的大鼠放入IVC笼具单笼饲养,术后恢复。禁食12-16h(自由饮水)后,从颈静脉推注浓度为6 g/L PAH溶液30 mg/kg后,静脉滴注浓度为3 g/L PAH溶液6mg/h/100g45min,然后开始计时,在大鼠清醒状态下,分别在1,5,10,15,20,25,30,40,50,60 min时间点采集血液样品。每个时间点采血后,均静脉输入同体积的生理盐水。在20,40,60 min收集大鼠尿液,并测量各时间段的尿液体积。采用HPLC分别分析血液和尿液中的PAH含量,计算PAH清除率。结果:1.大黄提取物和大黄总蒽醌剂量过高时可导致肾脏轻度损伤,但中、低剂量时无明显肝肾毒性大鼠灌胃给予大黄提取物高剂量组(16 g生药/kg,相当于临床剂量的10倍)于给药后出现软便、被毛不干净、无光泽、尿液颜色加深等现象;血清肌酐(CRE)水平较对照组升高(p0.001);雄性大鼠的肾脏重量显著性降低(p0.05)。高剂量组其他生化指标和低、中剂量组生化指标未见有明显毒理学意义的变化。病理检查可见,高剂量组(16 g生药/kg)肝脏出现轻微小灶状炎症细胞浸润,但与对照组比较差异不明显,故不认为有毒理学意义。高剂量组雌、雄大鼠的肾脏可见轻度或中度肾小管细胞肿胀、变性,少量炎症细胞浸润,其中雄性大鼠的肾脏病变较雌性大鼠稍重,有2只雄性大鼠可见片状炎症细胞浸润伴有成纤维细胞增生。中、低剂量组未见肝、肾病理损伤。大黄总蒽醌高剂量组(5 g/kg)给药后,大鼠体重明显下降,可能与饲料摄入减少有关。给药后大便稀软,被毛不干净,耸毛,无光泽。高剂量组给药后第4天可见大鼠行动迟缓,精神萎靡厌动;第7天雄性大鼠死亡一只。故于给药后第10天将各剂量组动物处死检查分析。高剂量组(5 g/kg)的血液肌酐增高(p0.01),与对照组相比升高162.5%。与对照组相比,高剂量组肾脏重量及肾脏指数显著性降低(p0.001)。病理形态学检查结果显示。高剂量组肝脏可见少数肝细胞嗜酸性增强,核浓染,但对照组也可见此现象,故毒理学意义不明显。高剂量组可见肾小管轻度肿胀、炎症细胞浸润;但低、中剂量组肝脏和肾脏未见明显病理改变。2.大黄提取物和大黄总蒽醌对大鼠尿液NGAL、KIM-1水平的影响大鼠灌胃给予大黄提取物1个月后,高、低剂量组雄性动物的尿液NGAL水平可见增高,其中高剂量组与正常组比较有显著差异(P0.05),但雌性大鼠尿液NGAL未见明显影响。雌雄合并的数据显示,低剂量组和高剂量组尿中NGAL水平分别较正常组提高22.78%和51.53%。其中,二个剂量水平对雄性动物尿液NGAL升高作用较雌性动物强。大黄高剂量组雌、雄大鼠的尿液KIM-1水平均显著降低(与正常组比较p0.01),但认为无毒理学意义。大鼠灌胃给予大黄总蒽醌10天后,各剂量组雌、雄动物的尿液NGAL水平均可见增高,可能与各剂量组的总蒽醌用药剂量均较大有关。KIM-1水平未见有毒理学意义的变化。3.大黄提取物和大黄总蒽醌对肾脏Clusterin、OAT1、OAT2mRNA表达的影响大黄提取物灌胃给药1个月,高剂量组肾脏组织的Clusterin mRNA表达较正常组明显下降(p0.01),其中雄性、雌性动物分别较正常组下降33%和19%。低剂量组肾脏组织的Clusterin mRNA表达无明显变化。大黄低剂量组雄性动物肾脏组织的OAT1 mRNA和OAT3 mRNA表达较正常组分别上调47%和62%。高剂量组雄性动物的OAT3 mRNA较正常组上调38%。大黄各剂量组给药后,雌性动物肾脏组织OATl mRNA、OAT3 mRNA表达无明显变化。大黄总蒽醌灌胃给药10天,中、高剂量组雌性大鼠的肾脏ClusterinmRNA表达较正常组下降290%和26%。中、高剂量组雌性和雄性动物肾脏组织的OAT1 mRNA分别较对照组下调21%、42%、43%、70%。高剂量组雌性动物肾脏OAT3 mRNA表达较正常组下调44%。4.大黄总蒽醌对对氨基马尿酸清除率的影响大黄总蒽醌5g/kg灌胃给药10天后,进行PAH清除实验。结果显示,给药组雌、雄动物各时间点血浆中PAH浓度均较对照组有所降低。雄性动物尿液中的PAH含量在给予PAH后前20min较对照组降低;雌性动物20～40 min和40-60min尿中PAH含量较对照组偏高。大黄，

本文编号：2660367