小鼠急性肝损伤及牛蒡子苷元保护作用的研究

发布时间：2020-05-12 19:38

【摘要】：肝脏不仅是人体最重要营养物质代谢器官,还是许多非营养物质如药物、毒物以及有毒代谢产物的生物转化器官,因此肝脏也被称为解毒器官。近年来,越来越多的研究表明肝脏也是人体重要的免疫器官,肝脏中还包括种类多样的免疫细胞,如kupffer细胞、树突状细胞以及淋巴细胞等,肝窦内皮细胞以及肝星状细胞也具有免疫功能。肝损伤是指在多种致病因素侵害肝脏导致肝细胞损害,肝脏功能受损,导致肝脏不能发挥正常功能,进而引发一系列症状,甚至引起死亡。常见的致病因素包括病毒、细菌、药物、化学毒物以及酒精等。临床上常见药物性肝炎和免疫性肝炎等,肝炎急性发作容易导致急性肝衰竭,肝脏代偿功能不足时容易引起死亡,肝移植是最好的治疗方法,但由于供体不足往往延误治疗时机,最终失去生命,因此肝衰竭的预防和治疗是一个亟需解决的难题,寻找治疗急性肝损伤的有效药物具有重要的临床意义。对乙酰氨基酚(Acetaminophen,APAP)是临床常用的解热镇痛药,过量服用会导致严重的肝坏死,但肝坏死的机制仍需要深入的研究。本研究采用腹腔注射APAP诱导小鼠急性肝损伤,在禁食的前提下200 mg·kg-1的APAP导致小鼠出现轻度的肝损伤,表现为转氨酶的轻度升高以及肝细胞肿胀,300 mg·kg-1的APAP导致小鼠出现重度的肝损伤,表现为转氨酶显著升高以及严重的肝坏死。轻度损伤肝组织与正常肝组织相比有36个差异蛋白,其中有24个上调和12个下调;坏死肝组织与正常肝组织相比有44个差异蛋白,其中有32个上调和12个下调。对44个差异蛋白进行分析表明下调的蛋白主要是抗氧化蛋白和解毒酶等保护性蛋白,上调的蛋白包括损伤坏死以及修复相关的蛋白,准确的区分损伤坏死与修复相关因子对于AILI的临床治疗具有重要的意义。进一步采用免疫组化对上调的蛋白进行验证和鉴定,结果表明Hsp70与PCNA表达一致,是肝脏修复再生相关蛋白;p-Stat3和PCNA、Hsp70表达一致仅在轻度损伤和修复区域的肝细胞表达,在坏死肝组织基本不表达,表明p-Stat3代表肝细胞修复再生;Stat3主要在肝坏死区域表达,与Hsp70和p-Stat3的表达完全不同,表明Stat3与肝坏死相关,同时还说明差异蛋白中显著上调的的Stat3主要是本底型Stat3;在损伤修复期Stat3向P-Stat3的转换体现了肝细胞的从死亡到再生的过程,此时,大量的巨噬细胞聚集在原来坏死组织处,我们推测Stat3可能是一个DAMP分子吸引巨噬细胞来清除坏死组织。免疫组化验证发现肝组织中过表达的P4hα1、Ncam、α-SMA和Cygb可能参与肝脏修复,它们不仅仅是肝星状细胞活化的标志物也可能代表肝细胞从损伤坏死到再生的一种中间状态;Hsp70、p-Stat3、Ncam、α-SMA和c-kit在轻度损伤的静脉周肝细胞表达,表明这群肝细胞在遇到毒性刺激等损伤因素时具有自我修复能力。蛋白质组学分析结合免疫组化验证展示了AILI损伤以及修复的机制以及影响因素,包括氧化还原系统的破坏以及坏死和修复再生相关因子的上调,其中本底型Stat3的累积可能与肝坏死相关,Hsp70和Stat3的活化与修复再生相关,P4hα1、Ncam、α-SMA和Cygb的表达表明肝细胞在肝损伤修复中的发挥主要作用。巨噬细胞在AILI肝损伤中的作用不仅通过吞噬作用清除坏死细胞碎片,还通过分泌和释放IL-6激活Stat3和Hsp70促进肝脏再生,并促进P4h等的表达促进肝细胞修复,因此抑制巨噬细胞的功能将不利于AILI的治疗。刀豆蛋白A(Concanavalin A,ConA)诱导的小鼠急性肝损伤模型是研究免疫性肝炎以及预测药物治疗效果的常用动物模型。本研究采用定量蛋白质组学方法对ConA诱导的肝炎模型的发病机制进行了进一步研究。在上调的蛋白中Adrm1会激活去泛素化酶Uch37导致泛素释放增加,Isg15会占据泛素结合位点,导致泛素应激,泛素应激激活P62介导的选择性自噬,Isg15和ISG化蛋白也通过P62介导的自噬进行降解,Pkr和Atg7导致LC3 Ⅱ表达增加,上述一系列的因素导致自噬负荷的增加,溶酶体的降解能力受损则会导致自噬流的中断,表现为P62和LC3 Ⅱ的累积。Stat1的上调表明是其介导了免疫系统的激活。免疫组化方法验证了 Stat1、Pkr、Atg7和Adrm1的上调,并证明了P62和LC3Ⅱ的在坏死组织的累积,自噬体的累积导致了肝细胞的死亡。IFN-γ/Stat1信号通路介导了免疫性肝损伤。据报道,在IFN-γ存在的环境中IL-6也可以通过激活Stat1发挥促炎作用。结果表明IFNγ/IL-6/Stat1信号通路介导了富集在免疫系统进程的蛋白表达的上调,提示在免疫性肝损伤治疗方面可以通过调控该信号通路减轻肝损伤。牛蒡子苷元是传统中药牛蒡子的主要活性成分,具有显著的抗炎作用,研究表明牛蒡子苷元能够抑制T淋巴细胞激活、抑制巨噬细胞炎症、抑制IFNγ/Stat1和IL-6/Stat3信号通路,推测牛蒡子苷元可能对ConA诱导的免疫性肝损伤具有保护作用。结果表明牛蒡子苷元可以显著降低ConA导致的小鼠死亡率,显著减轻病理损伤和改善肝功能,效果与阳性药环孢素A和醋酸泼尼松相当。牛蒡子苷元预处理可以显著降低促炎因子IL-6和IFN-γ的水平、升高抗炎因子IL-10的水平。蛋白质组学分析结果显示给药组的肝组织与模型组相比有37个差异蛋白,其中有5个上调,32个下调,差异蛋白分析结果表明牛蒡子苷元预处理可以显著降低富集在免疫系统进程上的蛋白表达水平,免疫组化和蛋白电泳结果表明牛旁子苷元预处理可以降低Stat1、Pkr、Bnip3、Beclin1、Atg7、Adrm1、LC3B和P62的蛋白表达,降低p-Stat1和p-Pkr的水平,RT-PCR分析结果表明牛蒡子苷元预处理显著降低了 Stat1、Pkr和Atg7的基因表达。以上结果表明牛蒡子苷元可以通过抑制IFN-y/IL-6/Stat1和IL-6/Bnip3信号通路减轻ConA诱导的小鼠肝细胞自噬和凋亡。本研究采用比较蛋白质组学方法揭示了免疫系统激活引发的自噬失调在ConA诱导的肝炎中的作用,提出在免疫性肝炎的治疗上自噬和凋亡同样具有重要的临床意义,牛蒡子苷元在治疗免疫性肝炎方面具有潜在的价值。总之,本论文研究的意义在于采用蛋白质组学分析结合免疫组化技术对AILI中损伤、坏死以及修复再生因素进行了分析和鉴定,对ConA诱导的免疫性肝损伤发病机制进行研究,通过对模型进行对比总结出参与两种肝损伤的Stats成员不同、炎症细胞作用不同,推测具有抗炎作用的牛蒡子苷元对ConA诱导的小鼠急性肝损伤具有保护作用,通过实验证实了牛蒡子苷元的治疗效果,并初步阐明了牛蒡子苷元的肝脏保护作用机制,结合文献报道自噬也是病毒性肝炎的治疗靶点和牛蒡子苷元的抗病毒作用,推测牛蒡子苷元可以应用于病毒性肝炎合并自身免疫性肝炎的患者的治疗,牛蒡子苷元对免疫性肝炎的保护作用值得进一步研究和开发。
【图文】：

仅在ＡＩＨ患者的血清中检测到ＩＬ－２和ＩＬ－１５的显著增加［４６］。逡逑综上所述，从ＡＩＨ患者血清和活检的研宄中获得的关于ＡＩＨ发病机制的了解可逡逑以被总结成图１［４７］：外部触发事件，例如病毒感染，在肝脏局部引发炎症。先天免疫逡逑系统的肝脏驻留细胞（巨噬细胞、树突状细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞）被激活并逡逑释放第一波炎症因子（细胞因子、趋化因子），这些炎症因子又吸引和／或激活先天免疫逡逑系统的其他细胞以及适应性免疫细胞，包括Ｂ细胞和Ｔ细胞。可能由于一个或多个逡逑病毒抗原和肝脏自身抗原之间存在结构相似性（分子模拟），或者由于在肝细胞损伤时逡逑暴露出隔离的“未知”自身抗原，导致特异性Ｂ和Ｔ细胞被激活和扩增。随后，通逡逑过肝细胞裂解（穿孔／颗粒酶Ｂ或补体介导的）或释放细胞毒素（如ＩＦＮｙ和ＴＮＦａ）的机逡逑制，慢性破坏得以延续。逡逑１０逡逑

图１肝细胞内ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ３在肝脏损伤炎症和再生方面的调控作用ｌ２８ｌ肝细胞内Ｓｔａｔｌ主要逡逑由ＩＦＮＹ激活，Ｓｔａｔ３主要由ＩＬ－邋６家族细胞因子激活。激活的Ｓｔａｔｌ二聚化并进入细胞核内参与炎逡逑症反应、抑制肝细胞再生。而激活的Ｓｔａｔ３则可参与抑制炎症、促进肝脏再生。通常情况下，肝逡逑内激活的Ｓｔａｔ３可以抑制Ｓｔａｔｌ信号传导阻止肝脏炎症发生。但Ｓｔａｔ３也可通过诱导产生肝细胞产逡逑生急性期蛋白，促进炎症的发生。肝细胞内Ｓｔａｔｌ和Ｓｔａｔ３分别通过Ｓ０ＣＳ１和Ｓ０ＣＳ３蛋白抑制，，逡逑相互调控。（注：ＩＳＧ：干扰素刺激基因；ＧＡＳ：干扰素ｙ激活序列）逡逑以上研究证实了邋ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ３复杂的生物学功能【５｜１，它们的异常表达可导逡逑致功能的改变，并对机体产生影响，比如会导致自身免疫性疾病、各种感染的易感性逡逑或癌症。通过对ＳＴＡＴ１和ＳＴＡＴ３的深入研究可以加强对肝病发病机制的了解，为进逡逑一步开发治疗药物奠定基础，但仍需要更多的深入细致的基础研宄以发现更多的发病逡逑机制以及调控机制，为临床预防和治疗肝脏疾病提供更多的理论支持。逡逑
【学位授予单位】：南京大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5


本文编号：2660737