基于线粒体功能调节的滇黄精缓解非酒精性脂肪肝药效及机制探究

发布时间：2020-05-13 15:39

【摘要】：背景:线粒体功能障碍是非酒精性脂肪肝病(Non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)的重要发病机制。从天然产物中开发线粒体调节剂/营养素以治疗线粒体功能障碍是防治NAFLD的有效策略。黄精(Polygonatum kingianum,PK)为重要药食两用资源,本课题组前期研究表明,滇黄精活性成分群(总多糖、总皂苷)可缓解2型糖尿病,其水提取也可以调节脂代谢异常。然而,滇黄精是否可缓解NAFLD及相关药理机制仍不清楚。目的:从线粒体功能调节角度,采用细胞和动物实验探究滇黄精对NAFLD的缓解作用及机制。方法:细胞实验:20只SD雄性大鼠,随机分为正常对照组(生理盐水)、含药肝线粒体组(滇黄精水提物,4 g/kg),连续灌胃给药6周,每天1次,正常对照组大鼠喂基础饲料,含药肝线粒体组大鼠喂基础饲料。于实验结束取新鲜肝脏,匀浆后用差速离心法制得肝线粒体,经甲醇沉淀后获得正常肝线粒体样品和滇黄精含药肝线粒体样品。将肝L-02细胞接种至6孔板中,分为正常组、模型组、给药组(线粒体样品),除正常组外其余各组用5%医用脂肪乳造模液诱导肝L-02细胞24h后,将线粒体样品(正常线粒体组50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL,滇黄精含药线粒体组50μg/mL、100μg/mL、200μg/mL)给予医用脂肪乳诱导的肝L-02细胞继续培养24h,显微镜下观察细胞中脂滴,并用试剂盒检测细胞中甘油三脂(TG)、总胆固醇(TC)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量。动物实验:63只SD雄性大鼠,随机分为正常对照组(生理盐水)、模型组(生理盐水)、白藜芦醇组(阳性对照,40 mg/kg)、生滇黄精水提物低、中、高剂量组(1、2、4 g/kg)、制滇黄精水提物低、中、高剂量组(1、2、4 g/kg),连续灌胃给药14周,每天1次,除正常对照组外其余各组大鼠喂高脂饲料14周诱发NAFLD。于14周眼角取血,试剂盒检测血清TG、TC、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)水平;处死大鼠后,测定脏器(肝、脾、肾)指数,试剂盒检测肝脏中TC、TG、HDL-C水平,检测肝脏线粒体中MDA、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)、ATP合酶及呼吸链复合物I、II水平;qPCR检测大鼠肝脏中UCP-2和CPT-1mRNA表达量;Western blot检测大鼠肝细胞凋亡相关蛋白(Caspase-3、Caspase-9、Cytchrome c、Bcl-2、Bax)表达量。结果:细胞实验:除正常组外,其余各组在医用脂肪乳诱导肝L-02细胞24 h后,均产生脂滴,给予滇黄精含药线粒体后,滇黄精含药肝线粒体组细胞中脂滴明显减少,且TC、TG、MDA水平显著降低(P0.01,P0.001),同时SOD活力显著升高(P0.001)。动物实验:高脂饲料喂养大鼠被成功诱发NAFLD,分别给予生、制滇黄精水提物后,发现大鼠肝指数显著降低,肝细胞肿胀、变性、坏死及炎性损伤减轻,肝脏TC、TG显著降低(P0.05,P0.01,P0.001)及HDL-C显著升高(P0.01),血清TC,TG,ALT,AST,LDL-C降低(P0.05,P0.01,P0.001)及HDL-C显著升高(P0.05),肝线粒体中MDA含量显著降低(P0.05)及SOD、GSH-PX、ATP合酶与呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ活性显著升高(P0.05,P0.01,P0.001),肝脏中UCP-2 mRNA显著下调及CPT-1 mRNA显著上调,肝脏中Caspase-3、Caspase-9、Bax表达量显著降低(P0.05,P0.01,P0.001),肝脏中Bcl-2与肝线粒体中Cytchrome c表达量显著升高(P0.05,P0.01,P0.001)。生、制滇黄精同剂量组间比较发现,制滇黄精血清ALT、AST、LDL-C水平显著低于生滇黄精(P0.05),制滇黄精肝脏TC水平显著低于生滇黄精(P0.05),制滇黄肝脏HDL-C水平显著高于生滇黄精(P0.01),生滇黄精MDA含量显著低于制滇黄精(P0.05,P0.01),生滇黄精SOD、GSH-PX水平高于制滇黄精P0.05,P0.01),制滇黄精Na~+-K~+-ATP酶、ComplexⅡ活力显著高于生滇黄精(P0.01,P0.001,P0.001),制滇黄精Caspase-9表达量显著低于生黄精(P0.05),制滇黄精Cytchrome c、Bcl-2表达量显著高于生滇黄精(P0.05,P0.001),生滇黄精Caspase-3、Bax表达量显著低于制滇黄精(P0.001)。结论:滇黄精含药肝线粒体可缓解医用脂肪乳诱导的肝L-02细胞脂肪变性,生、制滇黄精均能通过改善线粒体功能而缓解高脂饮食诱导的NAFLD,其机制可能与增强线粒体的抗氧化应激,能量代谢、脂肪酸β-氧化以及抑制肝细胞凋亡有关,滇黄精可用于防治NAFLD的线粒体调节剂(营养素)的开发。制滇黄精在降低血清与肝脏脂质,提高线粒体能量代谢及抑制线粒体介导的肝细胞凋亡方面效果优于生滇黄精,而生滇黄精抗氧化应激效果优于制滇黄精,结果为滇黄精的临床应用及资源深入开发利用提供重要科学依据。
【图文】：

含药,非诺贝特,线粒体,脂滴

结果精含药肝线粒体对脂肪变性肝 L-02 细胞，正常组细胞正常生长（图 1-1A），其余各组给予医图 1-1B～I），表明造模成功。给药 24 h 后，阳性药非粒体组低、中、高剂量组细胞脂滴数量较模型组一定程好，边缘规则清晰（图 1-2C、G、H、I），但正常线粒型组相比脂滴数目减少不明显（图 1-2D、E、F）。结体可明显减少医用脂肪乳诱导的肝 L-02 细胞中脂滴。A BC

含药,线粒体,非诺贝特,肝线粒体

图 1-2 给予含药线粒体 24 h 后的肝 L-02 细胞A，正常组；B，模型组；C，非诺贝特组；线粒体低剂量组；E，正常线粒体中剂量组；F，正常线粒体线粒体低剂量组；H，含药线粒体中剂量组；I，含药线粒体精含药肝线粒体对脂肪变性肝 L-02 细胞所示，，与正常组相比，模型组 TG 含量显著升高（P < 但无显著性，表明医用脂肪乳诱导肝细胞脂质异常。与黄精含药肝线粒体低、中、高剂量组肝细胞中 TG 含量P < 0.01，P < 0.05），而正常肝线粒体各剂量组肝细胞
【学位授予单位】：云南中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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