蒲公英提取物对LPS诱导的RAW264.7细胞的抗炎作用及对NF-κB信号通路的调控

发布时间：2020-05-13 18:09

【摘要】：蒲公英属(Taraxacum)植物是临床常用的中药材,是一种药食同源的植物。蒲公英味苦、甘,性寒,蒲公英因为其具有利胆、利尿和抗炎等药用效果所以长期以来作为药用。巨噬细胞作为先天免疫细胞,在巨噬细胞保护身体免受外来入侵者的侵袭吞噬时引发炎症和免疫应答。当受到脂多糖(LPS)刺激时,巨噬细胞被激活并释放多种促炎因子和细胞因子,其过度释放可能导致广泛的组织损伤和病理改变。在此过程中,巨噬细胞产生许多炎症介质如白细胞介素(IL)-6,肿瘤肿瘤坏死因子(TNF)-α、一氧化氮(NO)、前列腺素。产生过多的介质导致的各种生理障碍,包括肿瘤形成,自身免疫性反应与炎症性疾病。LPS是一种有效的单核细胞和巨噬细胞的诱导剂,是天然免疫应答的关键介质。由LPS刺激RAW264.7巨噬细胞导致细胞内信号传递,最终导致细胞因子和其他炎症介质构成促炎性介质的生产和分泌。因此本研究以LPS诱导巨噬细胞作为体外炎症模型。为提高蒲公英的药用和食用价值,进一步加大蒲公英的综合利用,本文对蒲公英醇提物、以及纯化了的糖蛋白和皂苷的抗炎作用进行了深入研究。通过利用LPS诱导的RAW264.7巨噬细胞为体外细胞炎症模型,研究蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷在体外抗炎活性,并采用MTT法检测其对RAW264.7细胞的增殖毒性,Griess reagent法检测了NO的分泌情况,RT-PCR检测炎症细胞因子白细胞介素(IL)-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α以及iNOS mRNA的表达水平,ELISA测定IL-6和TNF-α的分泌量,Western blot检测IκB-α蛋白的磷酸化水平,用以研究蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷对NF-κB信号转导通路的抑制作用。结果显示,蒲公英醇提物在(0-5.0mg/mL)、蒲公英糖蛋白在(0-1.0mg/mL)、蒲公英皂苷在(0-1.0mg/mL)范围内均对细胞的增殖活性无明显作用。RT-PCR结果表明,不同浓度的蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷均抑制了TNF-α、IL-6和iNOSmRNA的表达,又通过ELISA试验验证了蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能够抑制TNF-α和IL-6的分泌,这与mRNA的表达结果一致,并呈剂量依赖性。另外,蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷还能抑制NO的合成。以上实验数据表明,蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷在体外实验中能够通过调节细胞因子和炎性介质的分泌而发挥抗炎作用。我们又进一步对分析了LPS诱导的细胞因子和炎性介质的产生机制发现,在炎症信号通路中,最常见的信号通路NF-κB起了关键作用。本实验通过利用LPS诱导RAW264.7巨噬细胞,测定了蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷对NF-κB信号通路的影响。结果显示,LPS可显著上调IκB-α的磷酸化水平,而蒲公英醇提物、糖蛋白和皂苷能呈剂量依赖性的抑制IκB-α蛋白磷酸化水平,从而间接的证明了其能够通过调控NF-κB信号转导通路,抑制TNF-α和IL-6的分泌和TNF-α、IL-6和iNOS mRNA的表达以及NO的合成,从而发挥其抗炎作用。本研究证明了蒲公英醇提物具有抗炎效果,且醇提物中的糖蛋白和皂苷也起到了抗炎作用,并首次发现和证明了蒲公英糖蛋白在细胞炎症因子方面的抗炎分子机制,这不仅为蒲公英抗炎机制提供了依据,而且还为糖蛋白的抗炎分子机制研究提供了新的思路,同时也为开发蒲公英抗炎产品奠定了理论基础。
【图文】：

为筛选出蒲公英醇提物、蒲公英糖蛋白、蒲公英皂苷对RAW264.7细胞的最适浓度，采用MTT比色法检测RAW264.7细胞的增殖活性，将不同浓度的蒲公英醇提物、蒲公英糖蛋白、蒲公英皂苷与RAW264.7细胞共同孵育24h。具体实验分组及结果见图1。实验结果如图 1所示，每组与空白组相比无统计学差异。这表明蒲公英醇提物浓度在0-5.0mg/mL 的范围内，蒲公英糖蛋白浓度在 0-1.0mg/mL 的范围内，蒲公英糖皂苷浓度在 0-1.0m g/mL 的范围内，对 Raw 264.7细胞是没有毒性作用的。3.2 蒲公英提取物对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞合成 NO 的影响根据MTT实验结果，选取蒲公英醇提物的剂量分组为625，1250，2500μg/mL

3.3 蒲公英提取物对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症因子表达的影响3.3.1 蒲公英醇提物对 LPS 诱导的 RAW264.7 细胞炎症因子表达的影响由图3可以看出，，100ng/mL的LPS单独作用RAW264.7巨噬细胞24h后与空白对照组相比较，能极显著的上调IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达水平（P<0.01）。蒲公英醇提物与RAW264.7细胞共同孵育24h后，与LPS对照组相比，低、中、高剂量组均能显著或极显著的下调IL-6、TNF-α和iNOS mRNA的表达水平（P<0.05，P<0.01）且呈剂量依赖关系。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

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本文编号：2662336