基于质谱技术的定志小丸治疗阿尔兹海默症的体内外化学物质组研究

发布时间：2020-05-14 10:52

【摘要】：“定志小丸”源于唐代孙思邈的《备急千金要方》,由人参、茯苓、远志和石菖蒲按照一定的比例配伍组成,具有益气养心、定志益智等功效,是中药中治疗神经退行性疾病的基本方剂之一。但是,由于缺乏对其体内外化学物质组的系统研究,限制了其现代临床应用。本论文通过建立横向和纵向的关联分析策略,应用体内外代谢研究模型,结合液质和气质联用方法,系统地研究了定志小丸体内外化学物质组及其治疗阿尔兹海默症的体内药效物质组。其中,纵向的关联分析策略,是指对“代表性标准品单体成分-组方单味药-中药复方”物质组的层层递进分析。首先,对代表性单体成分的液质条件、质谱碎裂规律和体外代谢规律等进行研究和分析,获得各类成分的质谱特征诊断离子和代谢规律;其次,以代表性单体成分研究数据为支撑和指导,对各个单味药进行系统分析,总结其体内外多维化学物质组,形成数据库;最后,以各单味药多维化学物质组数据库为指导,对复方体内外多维化学物质组进行系统分析。而横向的关联分析策略,是指对“体外化学物质组-体外代谢物质组-体内代谢物质组-体内药效物质组”的逐层递进分析。首先,对定志小丸提取物进行了系统分析,归纳总结各类成分质谱碎裂规律、液相色谱保留时间、分子量和结构信息,系统阐明体外化学物质组并构建体外化学物质组库;其次,通过体外肠内菌代谢和肝微粒体代谢技术,依次建立了体外肠内菌代谢物质组和体外肝微粒体代谢物质组,该研究过程遵循了口服药在体内的代谢特点和规律;然后,通过对灌胃给药的大鼠进行分析,检测了定志小丸在体内各个主要脏器组织中的代谢情况,从而建立了体内代谢物质组;最后,以体内代谢物质组为导向,进行网络药理学分析(即靶向网络药理学分析),阐明作用于疾病靶点和通路的药效成分,最终明确确定志小丸体内药效物质组及其作用机制。1.体外化学物质组研究根据定志小丸中所包含的四种单味药(包括人参、远志、茯苓和石菖蒲)的化学成分特征不同,采取了针对性的分析策略。石菖蒲中的主要成分为挥发油,因此采用气质联用方法(GC-MS)对石菖蒲提取物进行了单独的分析,共鉴定出50个主要的挥发油成分,其中β-细辛醚的含量占总挥发油含量的70%以上。对于其它单味药则采用超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)方法进行分析,并通过UNIFI软件进行辅助解析,同时利用离子淌度技术分离茯苓化合物中的共流出物,依次建立了各个单味药的体外化学物质组,共鉴定了人参皂苷类化合物59种、远志化合物136种和茯苓化合物121种。2.体外代谢物质组研究体外代谢物质组主要包括体外肠内菌代谢物质组和肝微粒体代谢物质组。采用液质联用方法依次建立了人参、远志和茯苓的体外肠内菌代谢物质组,总结了其代谢规律。其中人参和远志化合物主要发生去糖基代谢,而茯苓化合物在体外肠内菌作用下基本不发生代谢。然后选取主要的肠内菌代谢物,利用体外肝微粒体孵育模型,进行了进一步的代谢研究。茯苓化合物在肝微粒体酶作用下,以四种氧化代谢为主,包括M+O-H2、M+O、M+O2-H2、和M+O2。人参化合物的肝微粒体代谢产物与其化学结构中糖基的位置有关,主要发生加氧和去氢两种代谢反应。远志化合物中只有远志寡酯A检测到了两个加氧代谢产物。3.体内代谢物质组研究通过关联分析各个单味药的体外化学物质组和体外代谢物质组,结合化合物的质谱碎裂规律及代谢规律,建立了各个单味药在尿液、粪便、血浆、肝脏和大脑等不同代谢部位的体内代谢物质组。同时将体外肠内菌代谢和体内粪便代谢、体外肝微粒体代谢和体内肝脏代谢情况对比分析,进一步验证了体外模型的可靠性和合理性。依次在各个单味药检测和鉴定了茯苓入血成分62个、人参入血成分113个、远志入血成分13个。同时利用气质联用技术在大鼠体内检测到β-细辛醚成分,阐明了定志小丸的体内代谢物质组。并进一步对比分析了定志小丸在正常大鼠和AD模型大鼠中的代谢情况,从化学组成变化的角度初步阐明了定志小丸治疗AD的潜在药效物质基础和作用机制。4.体内药效物质组研究以体内代谢物质组为导向,选取所有的体内入血成分,利用靶向网络药理学的手段,构建了“入血成分-对应靶点-疾病”的作用网络图,明确了定志小丸中治疗阿尔兹海默症的药效成分(Ginsenoside Rh2、Ginsenoside Rg3、Ginsenoside Rb1、Ginsenoside Rg1、Pachymic acid、Oleanolic acid、Poricoic acid B、Poricoic acid A、Poricoic acid C等)及其相应的作用靶点(如COX2、NR3C1、VDR、CASP3、NFKB1、IFNG、RARG、TNFα等),系统的阐明了定志小丸治疗阿尔兹海默症的体内药效物质组及其潜在的作用机制。
【图文】：

糖苷基架构的不同而将其分为两组：达玛烷型和齐墩果烷型。其中达玛烷型结构逡逑的人参皂苷根据其糖基取代基的不同，又可被细分为人参三醇型和人参二醇型皂逡逑苷，见图１－１所示。逡逑现代药理学研宄证明，人参皂苷在抗肿瘤、抗炎、降糖等方面，均具有较好逡逑的药理作用逦。人参阜苷邋２５－ｍｅｔｈｏｘｙｌｐｒｏｔｏｐａｎａｘａｄｉｏｌ邋和邋２５－逡逑１逡逑

１．提取条件优化逡逑称取相应比例的定志小丸（人参、远志、茯苓、石菖蒲质量比为３：邋３：邋２：逡逑２），对不同的提取方式进行优化考察，如图２－１。首先是对提取溶剂的考察，分逡逑别选用蒸馏水、９５％乙醇、正丁醇、乙酸乙酯四种溶剂，按照１：１０的比例加入到逡逑定志小丸粗粉中，进行超声提取。利用质谱直接进样的方法对提取物进行了分析逡逑对比。结果显示，茯苓三萜属于非极性化合物，采用蒸馏水作为提取溶剂的提取逡逑方法，不能有效地提取三萜类化合物。采用乙酸乙酯虽然能够有效地提取茯苓三逡逑萜类成分，但其他化合物的有效成分明显减少。因此，这两种提取溶剂都不是最逡逑佳的选择。对比采用正丁醇和９５％乙醇作为提取溶剂的提取方法，两种提取溶剂逡逑的提取效率相差不大，人参中的人参皂苷，，远志中的远志蔗糖酯、远志寡酯、远逡逑志皂苷和口山酮以及茯苓三萜类成分都得到有效的提取。从经济绿色等角度出发
【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：O657.63;R286.0


本文编号：2663236