桑黄多酚在肺损伤中的保护作用及机制研究

发布时间：2020-05-14 17:02

【摘要】：急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)和呼吸窘迫综合症(Acute respiratory distress syndrome,ARDS)是一种通过直接或间接因素导致的肺泡毛细血管屏障受损,炎性细胞浸润、促炎细胞因子和氧化应激反应产生的致命性疾病,进而造成急性进展性顽固性呼吸衰竭,最终形成不可逆的肺间质纤维化。ALI已严重影响患者呼吸系统功能,生活质量甚至危及生命,即使应用目前现有的临床治疗措施,但该病最终仍会进展成为肺间质纤维化,大大降低患者的生活质量,且无特效药物逆转该疾病的形成及进展。研发治疗肺损伤的药物,提升病患生活质量,降低患者死亡率,已成为目前亟需解决的问题。ALI及特发性肺间质纤维化(Idiopathic pulmonary fibrosis,IPF)本质上是呼吸道及肺组织中的失控性炎症及氧化反应。博来霉素(Bleomycin,BLM)是糖肽类抗真菌药物,此药物目前多用于经气管给药至小鼠肺内,模拟急性肺损伤及纤维化的发病过程,诱导ALI和纤维化动物模型。BLM刺激肺组织初期可引起炎症及氧化反应,产生并加重急性肺损伤病情及进展,最终形成IPF,因此控制炎症和氧化-抗氧化失衡是改善肺损伤的关键因素。再者,转化生长因子-β(Transforming growth factor-β,TGF-β)在肺损伤转为肺间质纤维化发病病程中,是促进成纤维细胞产生胶原蛋白的主要细胞因子。桑黄是一种多孔菌属,研究证实其有益于改善血液循环、缓解胃痛、抗炎、抗肿瘤、控制糖尿病和肺部感染。我们前期研究发现桑黄乙酸乙酯提取物(主要成分为多酚类物质)具有抗氧化、抗增殖和抗微生物等生物活性。然而,其是否具有缓解肺损伤等作用仍不清楚。本研究利用BLM诱导的ALI动物模型及体外TGF-β诱导肺纤维化细胞模型来探讨桑黄提取物(I.sanghuang extract,ISE)在ALI及肺间质纤维化中可能的保护作用,并初步探讨其潜在的作用机制。1.桑黄提取物在BLM诱导的急性肺损伤中的保护作用目的本章旨在从抗炎及抗氧化作用途径探究桑黄提取物对BLM诱导的ALI动物模型中的保护作用及机制探讨。方法将C57BL/6雌性小鼠随机分为4组,每组24只,分别为正常对照组、BLM组、BLM+0.15%ISE组、BLM+0.6%ISE组。各组小鼠提前摄入4周含有不同浓度的桑黄提取物饲料或正常饲料后,经BLM诱导后3天处死,收集以下标本并进行如下相关分析:(1)肺组织:HE染色病理切片观察形态学改变,称重肺组织评价干湿重比的变化,用蛋白印迹分析法(Western blot,WB)探究MAPK和NF-κB信号通路的影响,生化试剂盒测肺组织中MDA水平及SOD、CAT和GSH-Px酶活性;(2)支气管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid,BALF):采用流式细胞术(Flow cytometry,FCM)检测BALF中炎症细胞总数及亚群分类,用生化试剂盒检测BALF中总蛋白水平以及用ELISA法检测BALF中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的水平;(3)脾脏:分离脾细胞通过FCM检测中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞亚群分布并经LPS刺激24h后,ELISA检测其上清细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平;通过FCM检测T淋巴细胞亚群中CD3的表达,以及经ConA刺激72h后,FCM评价T淋巴细胞增殖的变化,ELISA检测其脾细胞上清细胞因子IL-2、IL-4和IFN-γ的变化。结果(1)ISE可以改善ALI病理特征,减少BALF内总蛋白渗出,降低BALF中炎症细胞的聚集及促炎细胞因子IL-1β(P0.05)、IL-6(P0.05)和TNF-α(P0.05)的水平;(2)ISE可减少肺部脂质过氧化产物MDA的产生(P0.05),增强抗氧化酶SOD(P0.05)、CAT(P0.05)和GSH-Px(P0.05)清除自由基的活性;(3)ISE能够抑制NF-κB信号通路(P0.05),但不影响MAPK信号通路;(4)ISE对脾细胞各亚群分布、LPS刺激产生炎症因子应答和ConA刺激后T细胞增殖及免疫应答影响较小,其中仅对细胞因子IL-1β及IL-2具有调节用作。小结桑黄提取物可减轻BLM诱导的小鼠ALI,该保护效应的关键可能是通过抗炎和抗氧化等实现的,其作用机制可能是与桑黄提取物影响NF-κB信号通路相关。2.桑黄提取物对TGF-β诱导人肺腺癌肺泡上皮细胞A549上皮间质转化的保护作用目的本章旨在研究桑黄提取物对TGF-β诱导人肺腺癌肺泡上皮细胞A549上皮间质转化的保护作用及其机制研究。方法将生长状态良好的A549细胞随机分为4组:正常组、TGF-β组、TGF-β+ISE(2μg/mL)组、TGF-β+ISE(4μg/mL)组。用浓度为2μg/mL和4μg/mL的桑黄提取物分别对A549细胞预处理1h后,加入TGF-β(5ng/mL)对其进行诱导。24h后观察细胞形态,收集细胞进行检测,WB法检测细胞中的E-Cadherin、Vimentin、Snail、α-SMA、p-Samd2/3、Smad2/3的变化。其次,用CCK-8试剂盒检测桑黄提取物是否对A549细胞具有毒性作用。结果(1)ISE能改善TGF-β诱导的A549细胞纤维化形态变化及迁移能力;(2)ISE能够抑制细胞上皮型向间质型转化;(3)ISE可以抑制TGF-β诱导的A549细胞上皮-间质转化的机制可能是通过影响Smad2/3的活化实现的,而不是通过ISE的直接毒性作用所介导的。小结桑黄提取物抑制TGF-β诱导的A549细胞上皮间质转化作用机制可能通过影响Smad2/3通路活性实现的。3.结论本研究从体内外初步探讨桑黄提取物对BLM诱导的小鼠急性肺损伤,TGF-β诱导人肺腺癌肺泡上皮细胞A549上皮间质转化两个模型的药理作用。机制结果提示桑黄提取物在肺损伤早期具有抗炎和抗氧化的效应,该效应可能是通过影响NF-κB信号通路所介导的,同时在肺损伤晚期抗纤维化作用可能与调控Smad2/3信号通路有关。
【图文】：

桑黄,提取物,对博,霉素

图 1 桑黄提取物对博莱霉素诱导的小鼠体重影响提取物在博莱霉素诱导前（A）和博莱霉素诱导后（B）体重下数±标准偏差（n=12 只/组），ISE 表示桑黄提取物，BLM 表示

桑黄,急性肺损伤,对博,病理学变化

图 2 桑黄提取物对博莱霉素引起急性肺损伤病理学变化照组，10×；（B）BLM 组，10×；（C）BLM+0.15%ISE 组，10×E）肺组织病理学评分。与正常对照组相比，*P<0.05；与 BLM 组相E 组相比，▲P<0.05。数值是以平均数±标准偏差（n=12 只/组）。I
【学位授予单位】：河南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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