化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠肾组织Notch和Hh信号通路表达的干预作用

发布时间：2020-05-15 00:28

【摘要】：目的:研究化瘀通络中药对糖尿病肾脏病(diabetic kidney disease,DKD)大鼠肾脏损伤的干预作用,并探讨其作用机制是否与调控肾组织Notch和Hedgehog(Hh)通路的激活有关。方法:60只健康雄性SD大鼠,随机选取10只作为正常组(C组),50只为造模组。造模组大鼠给予高糖高脂饲料喂养联合小剂量(35 mg/kg)链脲佐菌素(streptozotion,STZ)腹腔注射以建立糖尿病大鼠模型。成模大鼠随机分为模型组(M组)、化瘀通络中药组(Q组)和厄贝沙坦组(I组)。Q组和I组分别给予相应药物灌胃,C组和M组予相应体积的纯净水灌胃,连续灌胃16周。期间定期监测血糖、饮水量、进食量、尿量、24h尿蛋白定量;于第16周末大鼠称重,麻醉后留取血、尿标本,取右肾称重,留取肾组织标本,采用光镜、电镜进行病理学观察;采用免疫组织化学(immunohistochemistry technique,IHC)、实时定量PCR(Real-time PCR)和蛋白印迹法(Western Blot)对Notch和Hh信号通路中相关蛋白及m RNA表达进行检测。结果:1化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠“瘀血阻络证”的干预作用1.1大鼠一般状况C组大鼠一般状况良好,糖尿病(diabetes mellitus,DM)造模成功后,M、Q、I组大鼠出现不同程度的毛色晦暗、反应迟钝、舌色爪色紫暗等症状,于第12周部分大鼠出现脓疮等并发症。于第12周开始,各治疗组大鼠与模型组相比,上述症状有不同程度减轻。1.2随机血糖和血脂水平与C组相比,各造模组大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平明显升高(P0.01)。而与M组相比,化瘀通络中药组大鼠甘油三酯、低密度脂蛋白胆固醇和极低密度脂蛋白胆固醇水平明显降低(P0.01)。各造模组大鼠的随机血糖值,组间比较未见统计学差异(P0.05)。1.3 24小时尿蛋白定量检测结果从干预第4周末开始,与C组对比,各造模组大鼠24小时尿蛋白定量均明显上升(P0.01);但于第12周和16周末,与M组对比,Q组和I组大鼠的24小时尿蛋白定量均明显降低(P0.01);于第16周末,Q组较I组明显降低(P0.01)。1.4血凝指标检测结果与C组比较,各造模组大鼠血浆凝血酶原时间(prothrombin time,PT)、活化部分凝血活酶时间(activated partial thromboplastin time,APTT)、凝血酶时间(thrombin time,TT)均明显缩短(P0.05或P0.01),国际标准化比值(international standardization ratio,INR)明显减小(P0.01),血浆纤维蛋白原(fibrinogen,FIB)水平明显升高(P0.01)。与M组比较,Q组大鼠PT、INR和APTT均明显增大(P0.05或P0.01),I组无明显差异(P0.05)。在TT和FIB方面,各造模组之间无统计学差异(P0.05)。2化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠肾脏损伤的干预作用2.1肾脏肥大指数比较与C组对比,各造模组大鼠肾脏肥大指数明显升高(P0.01);而与M组对比,Q组DKD大鼠的肾脏肥大指数明显降低(P0.01)。2.2光镜及透射电镜观察结果光镜观察可见各造模组大鼠出现不同程度的肾小球体积增大,肾小囊腔隙狭窄,肾小球基底膜增厚,系膜基质增多,肾小管上皮细胞肿胀;电镜可见基底膜不规则性增厚,足突部分融合;而各治疗组病理改变较模型组有不同程度减轻。2.3肾功能检测与C组对比,各造模组大鼠血肌酐、尿素氮及尿酸水平均显著升高(P0.01);与M组对比,Q组大鼠的血肌酐和血尿酸水平显著降低(P0.01)。3化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠肾组织Notch通路表达的干预作用3.1 Real-time PCR检测肾组织Notch1、Jagged1、HES1和Hey1 m RNA表达与C组对比,各造模组大鼠肾皮质Notch1、Jagged1、HES1和Hey1m RNA表达量明显升高(P0.01);与M组对比,Q组和I组大鼠Notch1、Jagged1、HES1和Hey1 m RNA表达量均明显减少(P0.01);与I组对比,Q组大鼠HES1 m RNA表达量明显减少(P0.01)。3.2免疫组化法检测肾组织Notch1、Jagged1、HES1和Hey1蛋白表达Notch1蛋白阳性信号主要定位于肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞的胞浆,呈黄色或棕黄色颗粒状;Hey1蛋白阳性信号主要定位于肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞的细胞核和/或胞浆;HES1蛋白阳性信号主要定位于肾小球固有细胞、肾小管上皮细胞的细胞核;Jagged1蛋白阳性信号主要定位于肾小管上皮细胞的胞浆。Notch1、HES1、Hey1和Jagged1蛋白于C组大鼠有少量表达,M组表达明显增多,Q组和I组较M组有所减少。3.3 Western Blot检测肾皮质中Notch1、Jagged1、HES1和Hey1蛋白表达与C组对比,各造模组大鼠Notch1、Hey1、HES1和Jagged1蛋白的表达量均明显增多(P0.01);与M组对比,Q组和I组大鼠Notch1、Hey1、HES1和Jagged1蛋白的表达量均明显减少(P0.01);与I组对比,Q组Hey1和HES1两种蛋白表达量明显减少(P0.01)4化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠肾组织Hh通路表达的干预作用4.1免疫组化检测各组大鼠肾组织GLI1、SHH、FSP1、LN蛋白结果GLI1、SHH、FSP1和LN蛋白的阳性信号均定位于肾小管上皮细胞的胞浆,呈黄色或棕黄色颗粒状。C组大鼠GLI1、SHH、FSP1、LN蛋白表达微弱,M组大鼠表达明显增多,Q组和I组表达量较M组有所减少。4.2 Real-time PCR检测肾组织GLI1、SHH、FSP1 m RNA表达与C组比较,各造模组大鼠GLI1、SHH、FSP1 m RNA表达均明显增多(P0.01);在SHH m RNA表达方面,与M组比较,Q组和I组表达量均降低(P0.05),Q组和I组之间无统计学差异(P0.05)。在GLI1和FSP1 m RNA表达方面,与M组比较,Q组和I组表达量均降低(P0.01);与Q组比较,I组表达量增加(P0.05或P0.01)。4.3 Western Blot检测各组大鼠肾组织GLI1、SHH、FSP1蛋白结果与C组对比,各造模组大鼠GLI1、SHH、FSP1蛋白的表达量均明显增多(P0.01);与M组对比,Q组和I组大鼠GLI1、SHH、FSP1蛋白的表达量均明显减少(P0.01);与I组对比Q组GLI1、SHH、FSP1蛋白表达量明显降低(P0.01)。结论:1.模型大鼠血糖升高后逐渐出现蛋白尿及DKD肾脏病理改变,提示DKD模型复制成功。且模型大鼠存在糖脂代谢紊乱,血液处于高凝状态,出现典型的血瘀症状,符合中医瘀血阻络证改变。2.化瘀通络中药能明显改善DKD大鼠瘀血阻络状态,降低大鼠尿蛋白,减轻肾脏病理损伤,对大鼠肾脏有明显的保护作用。3.化瘀通络中药能够抑制Notch通路Notch1、Jagged1、HES1和Hey1蛋白的高表达,这可能是其减少尿蛋白排泄,减轻肾脏损伤的作用机制之一。4.化瘀通络中药能明显抑制Hh通路的部分活化,从而减少FSP1和LN的表达,这可能是其减轻肾小管损伤和肾间质纤维化的重要途径之一。
【图文】：

化瘀通络,血糖,大鼠

-1 化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠不同时间点随机血糖的[mmol/L, (x )]1-1 Effects of Huayu Tongluo herbs on random blood glucose (Rith diabetic kidney disease at different time points [mmol/L, (xcontrol; M, model; Q, Huayu Tongluo herbs; I, irbesartan)

化瘀通络,糖化血红蛋白,大鼠

化瘀通络中药对糖尿病肾脏病大鼠不同时间点随机[mmol/L, (x )]1 Effects of Huayu Tongluo herbs on random blood glth diabetic kidney disease at different time points [mmcontrol; M, model; Q, Huayu Tongluo herbs; I, irbes
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】