基于微流控芯片技术的荆芥黄酮抗肺癌有效成分配伍规律及作用机制初步研究

发布时间：2020-05-15 02:23

【摘要】：目的本研究课题是国家“中药复方多组分配伍筛选集成化微流控芯片的构建及新药筛选”“十二五”“重大新药创制”科技重大专项(项目编号:2013ZX09507005-005)以及辽宁省教育厅一般项目(项目编号:L201605)的一部分。本文基于微流控芯片技术探讨荆芥黄酮诱导肺癌细胞凋亡的作用;分析荆芥黄酮组分的组成及配伍规律,并初步阐明荆芥黄酮诱导肺癌细胞凋亡的分子作用机制。为以药理药效为导向的质量控制模式及抗肺肿瘤类新药开发控制提供一定数据参考。方法1.采用软光刻、模塑法以及等离子键合技术构建一种用于体外抗肺肿瘤药效学筛选的芯片,并采用荧光色素试剂对该芯片的性能进行考察。2.在微流控芯片技术的基础上,以细胞凋亡坏死率(%)为考察指标,采用Hoechst33342/碘化丙啶(PI)双染技术开展不同产地荆芥药材及不同药用部位黄酮类组分对人肺癌细胞A549的药效学研究。3.采用高效液相色谱法进行荆芥药材黄酮类组分指纹图谱的建立及含量检测,灰色关联度分析软件进行谱效关系分析,HPLC-Q-TOF-MS对其药效相关性成分进行快速分析与鉴定,确定其药效相关性化学成分。4.以凋亡坏死率(%)为检测指标,对荆芥黄酮中药效相关性成分进行体外药效学的研究,并采用均匀设计的方法筛选出其体外抗肺肿瘤作用的最佳配伍比例。5.采用Annexin V-FITC/PI双染色法及PI单染色法进行流式细胞仪检测,探讨荆芥黄酮诱导人肺癌细胞A549周期分裂及凋亡坏死的影响。6.采用PCR以及Western Blot等相关技术,检测荆芥黄酮对人肺癌A549细胞中Micro RNA以及相关基因及蛋白的相对表达,双重角度阐释荆芥抗肺肿瘤的初步作用机制。结果1.本实验设计并制作了一种双层PDMS芯片。在第一PDMS薄膜层上集成有a、b、c、d、e、f、g、h共16个气动微阀,其中aa1为一对配合使用,共8对;8个液阀,分别为液阀A、B、C、D、E、F、G、H;第二PDMS薄膜层上有细胞培养腔4×4列椭圆形结构以及相应的流体通道结构,四个模块通过一个共用废液口。测试结果显示:集成有微阀结构的微流控芯片液阀及气阀均在72 h内具有良好的阀控隔离能力;芯片中肺癌A549细胞生长状态良好,细胞存活率能达到98%以上,可用于后期实验研究。2.基于微流控芯片技术进行荆芥黄酮类组分对人肺癌细胞A549的体外药效结果显示:荆芥黄酮类组分对人肺癌细胞均具有一定抑制作用,但作用强弱存在一定差异。在相同浓度和时间的条件下,安徽产地药效最好,凋亡坏死率达到(67.40±3.56)%;广东产地药效最差,凋亡坏死率仅为(10.91±1.26)%。而同一荆芥植株不同药用部位的体外药效实验显示其抗肺肿瘤的作用效果:叶根花茎。3.本研究基于高效液相色谱法建立了荆芥黄酮类组分的指纹图谱,其中共有20个指纹色谱峰,通过相似度评价分析表明:不同产地药材间相似度存在一定差异性。S1(安徽)、S2(甘肃)、S5(河南-商丘)、S7(湖北)、S8(四川)、S9(云南)为第一类,相似度均达到0.95以上;S6(河南-亳州)为第二类,相似度均达到0.85以上;S3(广东)和S4(河北)为第三类,相似度仅为0.36左右;谱效关系分析结果显示:20个共有峰所代表的化学成分与抗肺肿瘤作用有较高的关联性,顺序从强到弱依次为:19th6th10th12th20th16th11th18th,初步鉴定6种单体化学成分分别为槲皮苷、橙皮苷、芹菜素、香叶木素、木犀草素、木犀草苷。4.采用高效液相色谱法对9种不同产地荆芥药材中关联系数较大的6种化学成分进行含量检测,其中总黄酮含量分别在7.58 mg·g-1至17.91 mg·g-1范围内,其中安徽产地含量最高。根据其含量检测结果9种产地荆芥药材聚类分析共聚为3类,安徽产地药材为第一类,河南-商丘与广东产地药材聚为第二类,其余6种产地药材聚为第三类。5.6种单体成分在相同浓度的条件下,作用效果木犀草苷槲皮苷木犀草素芹菜素香叶木素橙皮苷;均匀设计实验结果显示:12个配伍组均具有一定诱导肺癌细胞凋亡的作用,凋亡坏死率在(27.68±1.674)%-(81.00±5.154)%之间。其中配伍三效果最佳;进而推测出木犀草素、木犀草苷、槲皮苷、橙皮苷、芹菜素、香叶木素按照3.06:2.90:2.04:4.17:0.12:2.75的比例配伍药效最佳。6.通过流式细胞仪检测结果显示:荆芥黄酮类组分及单体成分均具有一定诱导人肺癌细胞A549凋亡的作用,其中最佳配伍组作用最强凋亡坏死率为(67.9±1.2)%,荆芥黄酮高剂量组作用次之,凋亡坏死率可达到(52.5±0.7)%。其余各给药组强弱依次排序为:木犀草苷槲皮苷木犀草素荆芥黄酮中剂量组芹菜素香叶木素橙皮苷荆芥黄酮低剂量组。此外,尚能显著抑制人肺癌细胞的分裂,抑制肺癌细胞G0/G1期及S期,X椉覵期细胞比例从而延缓肿瘤细胞的发展。7.PCR检测结果显示:荆芥黄酮作用于人肺癌细胞A549后,干预PI3K-AKT信号通路中部分关键分子的表达,micro RNA 126(mi R-126)和PTEN的表达上调,VEGF和PI3K的表达下调;6种单体成分及最佳配伍组中PTEN表达上调,VEGF和PI3K表达下调。8.Western Blot检测结果显示:荆芥黄酮作用于人肺癌细胞A549后,干预PI3K-AKT信号通路中部分关键分子的表达。不同程度的降低了VEGF、AKT、Bcl-2及Cyclin B1蛋白的相对表达,增加了PTEN及PI3K蛋白的相对表达;6种单体成分及最佳配伍组降低了AKT和Cyclin B1蛋白的相对表达,木犀草素能降低PI3K的表达,芹菜素、香叶木素以及橙皮苷能增加PI3K的表达。除橙皮苷和最佳配伍组外,均能增加PTEN的表达、降低Bcl-2的表达。结论1.本实验构建了一种用于抗肺肿瘤药效筛选的微流控芯片,以满足目前的实验需求。并凭借其操作灵活简单、实验成功率高、结果稳定、制作成本低等优势成功应用于不同产地荆芥和不同药用部位的体外药效学研究。2.基于微流控芯片技术的体外药效试验研究结果表明:由于产地不同所处的气候以及环境不同,对化学成分的分布造成一定影响,导致不同产地荆芥药材黄酮类组分体外抗肺肿瘤作用存在一定差异。其中安徽为荆芥药材主产地之一,其效果较佳;不同药用部位药效试验结果显示根部也具有一定诱导肺肿瘤细胞凋亡的作用,所以根入药可以扩大药用。所以针对不同产地以及不同药用部位的研究可为荆芥药材作为抗肺肿瘤类药物治疗的开发及合理利用提供一定理论依据。3.本研究通过高效液相色谱法以及灰色关联度软件得到荆芥黄酮类组分整体特征指纹图谱和药效贡献度较大的色谱峰,在此基础上并对其进行了多指标成分的含量检测。该方法稳定、可行,进一步为荆芥药材的质量控制以及评价体系提供一定的参考价值。4.本研究基于微流控芯片技术初步完成了荆芥黄酮类组分中6种单体成分的配伍规律研究,其结果显示:不同单体成分体外抗肺肿瘤作用存在一定差异,进一步说明各化学成分混合在一起所发生的药效结果并不是单体药效的简单叠加,此次均匀实验设计优选出的最佳配伍比例效果优于同等剂量的荆芥黄酮总组分,上述实验结果为后期联合用药的深入研究奠定前期实验基础。5.荆芥黄酮类组分、单体黄酮成分以及最佳配伍组在一定浓度范围内,均具有一定诱导细胞凋亡、抑制细胞分裂的作用,但是其作用点有所不同,荆芥黄酮作用于S期较显著,单体成分作用于G0/G1期、S期、G2/M期各异。说明单体成分相互作用部分协同增加抑制S期分裂,部分拮抗作用于G0/G1期和G2/M期。该实验结果进一步验证了中药多靶点的作用理念,说明中药发挥疗效是多种化学组分协同作用的结果。6.荆芥黄酮化学成分复杂,一方面,各给药组均不同程度地上调抑癌基因PTEN的表达,从而干扰PI3K/AKT信号通路,导致了PI3K以及VEGF下调,进而促进了肿瘤细胞的凋亡。另一方面,mi R126在PI3K/AKT以及VEGF两条信号通路中具有重要作用,VEGF是已经被证实的mi R-126的作用靶点,荆芥黄酮干预了相关蛋白的表达,参与了机体代谢网络的调控。揭示出荆芥黄酮干预肺肿瘤细胞作用的重要途径,明确了荆芥黄酮体外抗肺肿瘤作用的初步作用机制。7.荆芥黄酮作用于PI3K-AKT信号通路,并且调控了相关蛋白的表达,值得注意的是:并非一种基因调控对应的一种蛋白。对于周期蛋白(Cyclin B1)不同给药组均具有一定作用。而凋亡蛋白(Bcl-2)只有配伍组作用不显著。初步推断荆芥发挥抗肺肿瘤的作用是各成分综合调控共同作用的结果,并不是简单的机制累积。
【图文】：

示意图,芯片,示意图,图形结构

图 1-1-1 芯片的示意图Fig.1-1-1 Schematic diagram of the chip.2 芯片的制作本实验采用 CorelDRAW X6 绘制该芯片的图形结构文件，并将其打印成光刻掩膜

芯片,实物

-2芯片的实物图
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【参考文献】