益气活血解毒中药调控SGK-1表达抑制醛固酮诱导HK2细胞自噬的研究

发布时间：2020-05-15 21:02

【摘要】：目的:观察益气活血解毒中药血清(Yiqihuoxuejiedu drug serum,TCM)、肾上腺髓质素(Adrenomedullin,ADM)抑制醛固酮(Aldosterone,ALD)诱导的人近端肾小管上皮细胞(HK2)自噬的作用。方法:本实验采取HK2细胞作为研究对象,采用1μMol/L醛固酮浓度作为自噬的诱导条件,给予10%的益气活血解毒含药血清、100nMol/L的肾上腺髓质素治疗。实验分组为对照组(CON),醛固酮组(ALD),醛固酮(ALD)+益气活血解毒含药血清(TCM),醛固酮(ALD)+肾上腺髓质素组(ADM),48小时后收集细胞并观察变化。采用免疫细胞荧光,Western blot方法检测血清糖皮质激素诱导蛋白激酶1(Serum and glucocorticoid induced kinase,SGK-1),磷酸化细胞外信号调节激酶1/2(Phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,PERK1/2),磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphorylated target of rapamycin,P-mTOR),自噬相关基因5(Autophagy associated gene,Atg5),酵母自噬基因6(Atg6)的同源物Beclin1,自噬标志微管相关蛋白1轻链3(Microtubular-associated protein 1 light chain 3,LC3)的表达。结果:1免疫细胞荧光检测自噬通路中SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR表达用激光共聚焦显微镜观察HK2细胞中SGK-1、P-ERK1/2和P-mTOR的表达,结果显示ALD刺激后SGK-1表达明显增强,主要表达于细胞浆中,与CON组相比有显著性差异;TCM、ADM治疗组表达较ALD组明显减弱。P-ERK1/2在ALD组的表达较CON组显著升高,胞浆及细胞核均见到表达;给以TCM、ADM干预后,表达明显降低。P-mTOR为自噬的负调控因子,CON组呈阳性表达,以胞浆为主,而ALD组表达明显减弱,TCM、ADM干预后较ALD组表达增强。2免疫细胞荧光检测HK2细胞中自噬相关蛋白Atg5,Beclin1和LC3的表达结果显示,ALD组自噬相关蛋白Atg5,Beclin1与CON相比均明显增多,主要分布在胞浆中,TCM及ADM组较ALD组明显减弱。CON组LC3在胞浆散在分布,而ALD诱导后,自噬体膜形成且主要与溶酶体融合,形成自噬溶酶体,自噬溶酶体在细胞质中成颗粒状分布,TCM、ADM干预后胞浆中颗粒状物质减少,且LC3明显散在分布整个胞浆。3 Western blot检测HK2细胞SGK-1,P-ERK1/2,Atg5,Beclin1和LC3Ⅱ/Ⅰ表达Western blot结果显示自噬信号通路中ALD组中SGK-1、P-ERK/ERK表达明显高于CON组,且差异有统计学意义(P0.01),TCM、ADM均可抑制其表达,两组差异无统计学意义(P0.05)。检测自噬抑制蛋白mTOR的表达,P-mTOR及总蛋白水平在ALD组均较CON组下调,且差异有统计学意义(P0.01),给以TCM、ADM治疗后,可以上调其表达。自噬相关蛋白Atg5,Beclin1,LC3是自噬过程中最重要的正调节因子,参与自噬体的形成,其中ALD组,Atg5,Beclin1,LC3较CON组表达增强,且差异有统计学意义(P0.01),TCM、ADM组与ALD组相比明显降低,且差异有统计学意义(P0.05)。结论:1醛固酮可诱导人近端肾小管上皮细胞发生自噬2肾上腺髓质素可通过调控丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)途径拮抗盐皮质激素受体复合物的活化所诱导的肾小管上皮细胞损伤,进而起到保护肾小管上皮细胞的作用3益气活血解毒中药可抑制人近端肾小管上皮细胞自噬,其可能的机制与下调SGK-1,P-ERK1/2的表达有关。
【图文】：

图 1 免疫细胞荧光法检测 HK2 细胞中 SGK-1 的蛋白表达（oil×630）Fig1 Expression of SGK-1 in HK2 cells by immunofluorescence assay图 7 western blot 法检测 HK2 细胞中 SGK-1 的蛋白表达Fig7 Expression of SGK-1 in HK2 cells by western blotSGK-1GAPDH55KD36KD

14 western blot 法检测 HK2 细胞中 SGK-1 的蛋白表7 Expression of SGK-1 in HK2 cells by western bloNote：△P<0.01 vs CON△△P<0.05 vs CON*P<0.01vs ALD**P<0.05 vs ALD
【学位授予单位】：河北中医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

【参考文献】

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本文编号：2665631