银杏叶提取物对ERK介导的胃癌侵袭转移的影响及其机制的研究

发布时间：2020-05-17 03:28

【摘要】：背景和目的:银杏叶提取物(EGb761)是我国传统中药材银杏叶的一种标准提取物。最近,大量研究表明EGb761具有广泛的抗肿瘤的作用。然而,EGb761对胃癌侵袭、转移的具体作用及其机制还不明了。本研究旨在探讨EGb761对人胃癌细胞SGC-7901侵袭、转移的影响及其机制,为探索更理想胃癌治疗方案提供理论依据。方法:1.体外细胞实验:体外培养胃癌SGC-7901细胞,待细胞长到对数生长期,采用0μg/m L,200μg/m L,400μg/m L,600μg/m L的EGb761处理胃癌SGC-7901细胞24小时,收集细胞,提取细胞蛋白。用Western Blot法检测不同浓度EGb761对胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白表达的影响。此外,采用特异性的ERK1/2抑制剂U0126(10μM)预处理细胞2小时后,再加入400μg/m L的EGb761处理SGC-7901细胞24小时;采用Transwell侵袭试验和划痕试验分别检测EGb761和(或)U0126对细胞侵袭和迁移的影响;并采用Western Blot法检测ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB P65、NF-κB p-P65、MMP2的蛋白表达。2.动物实验:建立裸鼠胃癌原位移植模型,1周后将裸鼠随机为空白对照组和EGB761组(40mg/kg,每周2次,腹腔注射),再饲养4周后处死裸鼠。测量两组裸鼠的原位肿瘤的大小,免疫组化检测原位肿瘤中ERK、NF-κB P65、MMP2的表达,HE染色确定裸鼠肝转移情况。结果:1.不同浓度的EGb761处理细胞后,0μg/m L组,200μg/m L组,400μg/m L组,600μg/m L组的ERK1/2的相对蛋白表达量分别是:0.826±0.051、0.730±0.045、0.436±0.041和0.236±0.030;对应的p-ERK1/2的相对蛋白表达量分别是0.746±0.025、0.676±0.046、0.383±0.041和0.193±0.032。表明EGb761可抑制ERK1/2和p-ERK1/2的蛋白表达,并呈一定的剂量依赖的关系。Transwell侵袭试验结果显示空白组、U0126组、EGb761组和EGb761+U0126组侵袭细胞数(个)分别为:126.33±15.27、77.00±11.00、68.00±8.54和29.33±7.50;划痕试验结果显示空白组、U0126组、EGb761组和EGb761+U0126组的划痕愈合率(%)分别是74.10±4.65、32.30±2.48、30.76±6.19和16.06±2.91。以上数据表明EGb761及U0126皆可抑制胃癌SGC-7901细胞的侵袭和迁移,联合使用EGb761与U0126能更有效地抑制胃癌细胞侵袭和迁移能力。Western Blot结果示,空白组、U0126组、EGb761组和EGb761+U0126组的ERK1/2的相对蛋白表达量分别是0.720±0.040、0.710±0.062、0.406±0.032、0.446±0.047;对应的p-ERK1/2的相对蛋白表达量分别是0.803±0.040、0.363±0.045、0.430±0.040、0.150±0.026;对应的NF-κB P65的相对蛋白表达量分别是0.820±0.087、0.636±0.041、0.643±0.041、0.313±0.047;对应的NF-κB p-P65的相对蛋白表达量分别是0.633±0.032、0.506±0.051、0.483±0.041、0.180±0.036;对应的MMP2的相对蛋白表达量分别是0.493±0.032、0.376±0.066、0.360±0.026、0.130±0.036。以上数据表明,EGb761能抑制ERK1/2、p-ERK1/2、NF-κB P65、NF-κB p-P65、MMP2蛋白的表达,与U0126联合使用能更显著地抑制ERK、NF-κB通路和MMP2蛋白的表达。2.空白组和EGb761组裸鼠原位肿瘤的大小(mm3)分别是317.48±151.32、63.89±53.92;空白组5只裸鼠中3只发生肝转移,EGb761组5只裸鼠中0只发生肝转移。原位肿瘤组织免疫组化结果示:空白组和EGb761组ERK1/2阳性的细胞比例(%)分别是75.80±5.89、15.40±3.43;对应的NF-κB P65的阳性细胞比例(%)分别是84.00±4.74、13.80±4.14;对应的MMP2阳性的细胞比例(%)分别是71.00±4.24、11.20±3.56。综上,EGb761通过抑制ERK、NF-κB通路和MMP2的表达来抑制胃癌原位肿瘤的生长,并且抑制胃癌的肝脏转移。结论:1.EGb761能有效抑制体内外胃癌细胞的侵袭和转移。2.EGb761可能通过抑制ERK/NF-κB/MMP2信号通路从而抑制胃癌的侵袭转移。
【图文】：

胃 癌 SGC-7901 细 胞 在 不 同 浓 度 的 EGb761(0μg/mL,200μg400μg/mL, 600μg/mL）中干预 24 小时，，提取细胞蛋白。用 Western Blo检测 ERK1/2、p-ERK1/2 的表达，用软件统计分析目的蛋白条带的灰度值GAPDH 灰度值的比值。结果表明不同浓度的 EGb761 干预胃癌细胞后200μg/mL 组、400μg/mL 组、600μg/mL 组的 ERK1/2、p-ERK1/2 的相对达量较空白对照组（0μg/mL 组）明显降低，呈一定的剂量依赖关系，差有统计学意义（表 1）（图 1）。表 1. 各实验组 ERK1/2、p-ERK1/2 的相对蛋白表达量(n=3, x ±s)0μg/mL 组 200μg/mL 组 400μg/mL 组 600μg/mL 组ERK1/2 0.826±0.051 0.730±0.045*0.436±0.041**0.236±0.030**p-ERK1/2 0.746±0.025 0.676±0.045*0.383±0.041**0.193±0.032***P<0.05 vs 空白对照组，**P<0.01 vs 空白对照组

用 U0126（10μM）预处理 SGC-7901 细胞 2 小时后和（或）EG（400μg/mL）处理 SGC-7901 细胞 24 小时，用 Transwell 侵袭试验测组细胞侵袭能力。结果表明 U0126 组和 EGb761 组侵袭细胞数较空白组明显减少，差异有统计学意义。EGb761+U0126 组较 U0126 组或 EG组能更显著减少侵袭细胞数，差异有统计学意义（表 2）（图 2）。表 2.各实验组的侵袭细胞数(n=3, x ±s)组别 侵袭细胞数（个）空白组 126.33±15.27EGb761 组 77.00±11.00** ##U0126 组 68.00±8.54** ##EGb761+U0126 组 29.33±7.50****P<0.01 vs 空白对照组；##P<0.01 vs EGB761+U0126 组
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

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本文编号：2667851