虎眼万年青总皂苷对结肠癌细胞自噬及凋亡的影响及相关机制研究

发布时间：2020-05-17 05:35

【摘要】：研究目的:虎眼万年青具有显著的抗肿瘤活性,其皂苷类化合物是主要有效成分之一,本实验目的在于研究虎眼万年青鳞茎和叶各自总皂苷对结肠癌的抗癌活性,观察其对结肠癌细胞凋亡、自噬的影响,以初步探讨抗结肠癌的作用机理以及寻找发现新的有效药用部位。方法:1.结肠癌裸鼠模型的制备、标本收集与相关指标测定;药物虎眼万年青总皂苷(OCA-TS)的提取。(1)制备模型、收集标本:每只裸鼠腋窝皮下接种为1×10~7/0.1ml混悬肿瘤细胞0.1ml。当裸鼠肿瘤体积达到100 mm~3时,认为荷瘤成功,将荷瘤裸鼠随机分为5组:模型组、阳性药组、OCA-TS组。根据分组分别进行药物灌胃处理,每天1次。药物处理7d后处死各组荷瘤裸鼠,收集各组裸鼠血清样本;取肿瘤组织及癌旁组织。肿瘤组织和癌旁组织部分10%中性甲醛溶液固定,部分液氮速冻转至-80℃保存备用。(2)用HE染色观察虎眼万年青总皂苷对肿瘤组织结构及细胞形态的影响;Western blot法检测肿瘤组织中ATG5、LC3 II/I、Beclin1、VDAC1的表达量;免疫组化法检测VDAC1表达(3)采用乙醇热回流法提取虎眼万年青鳞茎和叶中各自总皂苷(TS)成分。2.虎眼万年青总皂苷对结肠癌细胞系生长增殖、凋亡与自噬影响的检测:(1)细胞形态学检测:MTT比色法检测OCA-TS鳞茎和叶分别对结肠癌细胞增殖的影响;平板克隆形成实验(PCF)检测OCA-TS对结肠癌细胞Lo Vo的克隆形成能力;Annexin V-FITC/PI双染色流式细胞仪检测OCA-TS对人结肠癌细胞系凋亡与周期的影响。(2)Western Blotting法检测OCA-TS作用人结肠癌细胞后凋亡及自噬相关蛋白的表达情况;透射电镜下观察OCA-TS对人结肠癌细胞超微结构的影响以及观察自噬溶酶体的形成;用Ad-mCherry-GFP-LC3B腺病毒追踪OCA-TS作用人结肠癌细胞后产生的自噬流的变化结果:1.OCA-TS组用0.1g/kg、1 g/kg、10g/kg每日灌胃给药1次,各组连续给药7天,对裸鼠体内肿瘤的生长均具有抑制作用,10g/kgOCA-TS组肿瘤体积抑制率已接近阳性药组的54.95%;HE染色结果显示给药组细胞细胞核分裂明显减少,活跃度降低;Western-blotting结果显示:各组用药小鼠肿瘤组织中均有ATG5、LC3II/I、Beclin1等自噬相关蛋白的表达,且呈上调趋势;免疫组化结果,用药组VDAC-1蛋白阳性表达呈现染色棕黄色、棕褐色颗粒。2.(1)MTT结果显示虎眼万年青鳞茎和叶分别提取出的OCA-TS均能够抑制四种结肠癌细胞的增殖,并呈现出时间浓度的依赖,OCA-TS叶作用48h,IC_(50)分别为:RKO,1.28mg/ml;Caco-2,0.96mg/ml;HCT116,0.96mg/ml;LoVo,0.96mg/ml;OCA-TS鳞茎作用48h,IC_(50)分别为:RKO,1.17mg/ml;Caco-2,1.00mg/ml;HCT116,0.97mg/ml;LoVo,0.64mg/ml。OCA-TS鳞茎作用活性稍高于叶,Lo Vo细胞对药物作用更为敏感。LoVo细胞在OCA—TS作用以后,各组细胞克隆形成率明显下降,与MTT结果一致,也具有浓度依赖性。(2)OCA-TS诱导Lo Vo细胞凋亡,尤其早期凋亡明显,1mg/mlOCA-TS用药组,总凋亡率接近50%(P0.01);检测凋亡相关蛋白表达得到,药物作用后的LoVo细胞内抗凋亡蛋白Bcl-2表达下降明显,而促凋亡蛋白Bax表达则上调。(3)OCA-TS使Lo Vo细胞周期阻滞于G_1期。(4)电镜下观察到在1mg/mlOCA-TS用药组自噬溶酶体和自噬空泡的形成;LC3B腺病毒感染用药细胞后观察到自噬流的形成。结论:1.OCA-TS能够抑制裸鼠结肠癌转移模型动物体内的肿瘤生长2.细胞水平上,OCA-TS鳞茎和叶对结肠癌细胞系RKO细胞、Caco-2细胞、HCT116细胞以及LoVo细胞均具有明显的抑制细胞增殖的作用,说明虎眼万年青鳞茎和叶总皂苷提取物均具有抗肿瘤活性。四种结肠癌细胞对OCA-TS的作用存在敏感性差异,其中Lo Vo细胞对不同浓度的OCA-TS反应更为敏感。3.OCA-TS能够诱导LoVo细胞凋亡,调控Bcl-2家族抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Bax等的综合表达可能是其抗癌作用的可能机制之一4.OCA-TS对结肠癌体内体外都具有的抗癌活性,还可能与其都够诱导结肠癌细胞发生自噬有关。
【图文】：

移植瘤,HE染色,肿瘤细胞,活跃程度

图 1 裸鼠种植瘤体积（A：模型组；B：阳性药组；C：0.1 g/kgOCA-TS 组；D：1g/kgOCA-TS 组；E：10 g/kgOCA-TS 组 **P<0.01，与模型组比较）2. 对肿瘤组织结构及细胞形态的影响HE 染色后显微镜下观察，可见与模型组相比，阳性药组、OCA-TS 组肿瘤细胞数目明显减少，细胞核染色较浅，细胞核浆比例减小，核分裂相对减少，说明癌细胞活跃程度均有不同程度降低；10g/kgOCA-TS 组细胞胞浆还出现透明空泡；对照组肿瘤细胞排列密集，细胞异型性明显，核大深染，细胞核质比例明显增大，畸形核和核分裂相多见，细胞更活跃，见图 2。A B C D E0200肿瘤

模型图,肿瘤组织,条带,模型

图 3：肿瘤组织中 ATG5、LC3 II/I、Beclin1 蛋白的条带以及相对表达量的结果（A：模型组；B：阳性药组；C：0.1 g/kgOCA-TS 组；D：1 g/kgOCA-TS 组；E：10 g/kgOCA-TS组各组与模型组相比，P<0.01，，均有显著性差异）4. 免疫组化、Western blot 法检测肿瘤组织中 VDAC1 表达的结果VDAC1 主要分布在结肠癌瘤组织的细胞浆中，阳性染色呈现棕黄色、棕褐色颗粒。各治疗组肿瘤的 VDAC1 表达均高于模型组, 见图 4；统计分析结果表明存在着显著性差异。统计结果详见表 1。
【学位授予单位】：大连医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【参考文献】