马钱子碱对三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231血管生成拟态的影响及相关机制研究

发布时间：2020-05-19 08:39

【摘要】：背景与目的血管生成拟态(Vasculogenic mimicry,VM)是由侵袭性肿瘤细胞排列构成的不依赖于内皮细胞的管状结构。它可以模拟正常的血管,以确保肿瘤充足的血液供应。VM被证明与恶性肿瘤的增殖、侵袭、转移和不良预后相关,是抗血管生成治疗的主要障碍。因此,迫切需要发现抑制肿瘤VM形成的方法,这对改善肿瘤治疗具有重要的临床意义。马钱子碱是从传统药用植物马钱子的种子中提取的中药单体,在多种癌症模型中都表现出抗肿瘤活性。本课题组前期研究已证明马钱子碱具有潜在的抗肿瘤血管生成作用,但更深入的机制并不清楚。本研究从另外一种角度,探讨马钱子碱在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231细胞形成血管生成拟态中的作用及其机制。研究方法MTT法测定不同浓度的马钱子碱处理对MDA-MB-231细胞活力的抑制作用;Hoechst33342/碘化丙啶(HO/PI)染色检测不同浓度的马钱子碱诱导MDAMB-231细胞的死亡情况;Annexin V-FITC/PI双染后,采用流式检测不同浓度马钱子碱处理引起MDA-MB-231细胞凋亡情况;通过划痕实验和细胞侵袭实验,检测马钱子碱对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响;用免疫荧光染色,在激光共聚焦下观察马钱子碱对MDA-MB-231细胞骨架微丝和微管的影响。然后在体外利用Matrigel基质胶构建人乳腺癌细胞MDA-MB-231血管生成拟态模型;PAS染色检测MDA-MB-231细胞形成血管生成拟态的能力;进一步探明不同剂量的马钱子碱对血管生成拟态形成的影响;最后采用蛋白印迹法(Western blot,WB)检测不同浓度马钱子碱处理后,细胞内凋亡相关蛋白caspase-3和血管生成拟态的通路相关蛋白Eph A2、MMP-2、MMP-9的表达水平变化。结果1.在三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231中,马钱子碱以剂量依赖的方式抑制细胞增殖,并且仅在较高浓度下诱导细胞凋亡。蛋白印迹分析还显示,马钱子碱仅在较高浓度时,可以通过增加的剪切后的caspase-3诱导细胞凋亡。2.通过划痕实验和细胞侵袭实验,我们发现马钱子碱以剂量依赖的方式抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。3.在激光共聚焦显微镜下观察,我们首次发现,马钱子碱可以破坏MDA-MB-231细胞的F-肌动蛋白细胞骨架和微管结构,从而削弱侵袭性肿瘤的一些特性,如迁移、侵袭,并且这可能是马钱子碱抑制VM形成的机制之一。4.在Matrigel基质胶上,MDA-MB-231细胞具有形成VM结构的能力。进一步通过统计小管数量、交叉点数量、小管平均长度结果表明,马钱子碱呈剂量依赖的抑制VM形成。5.WB结果表明,不同浓度马钱子碱处理MDA-MB-231细胞后,细胞内血管生成拟态标志蛋白Eph A2、MMP-2、MMP-9的表达水平呈剂量依赖式下调。结论马钱子碱抑制人三阴性乳腺癌细胞系MDA-MB-231的细胞迁移、细胞侵袭和血管生成拟态形成,其机制与细胞骨架的破坏以及Eph A2、MMP-2、MMP-9蛋白的下调有关。
【图文】：

马钱子碱,细胞增殖,抑制作用

1 马钱子碱对 MDA-MB-231 细胞增殖的抑制作用 1a 显示了马钱子碱的分子结构。首先，我们在显微镜下观察到马钱子碱B-231 细胞的抑制作用。与对照组细胞相比，马钱子碱引起细胞形态改状变圆和缩小，长梭形逐渐丧失（图 1b）。MTT 实验结果表明，空白对照以及马钱子碱组（0.0625, 0.125, 0.25, 0.5, 1 或 2 mM）处理 MDA-M 24h 后，各组相对空白对照组的细胞活力分别为 98.200±0.998, 0.97.737±0.771, 93.80±1.068, 76.749±2.337, 52.038±2.961, 28.433±0.484（图 1高浓度（1, 2 mM）的马钱子碱处理细胞 24 小时后，细胞数明显减少（据来自三次独立实验结果。此外，计算可得，马钱子碱对 MDA-MB-23数抑制浓度（IC50）为 1.172mM。这些数据表明，马钱子碱处理对 MDA胞生长具有剂量依赖性的抑制作用。因此，我们使用低于 IC50 的剂量实验。

马钱子碱,细胞凋亡

Fig 1. The effect of brucine on MDA-MB-231 cell viability. (a) The chemical structure of brucine; (b)Bright field images; (c) Cell viability. The scale bar is of 100 μm.3.2 马钱子碱诱导 MDA-MB-231 细胞凋亡根据 Hoechst33342/碘化丙啶（PI）染色测定结果，我们发现马钱子碱处理 MDA-MB-231 细胞 24 小时后，较高浓度（1, 2 mM）马钱子碱处理组，细胞死亡明显增加，说明马钱子碱诱导剂量依赖性细胞死亡（图 2a）。进一步，我们用膜联蛋白 V/PI染色试剂盒对细胞染色，通过 FACS 测量细胞凋亡情况，实验结果说明马钱子碱可以引起细胞凋亡，但在 1mM 浓度下仅有 4.27%的细胞凋亡（图 2b）。蛋白印迹分析还显示，马钱子碱仅在较高浓度时，可以通过增加的剪切后的 caspase-3 诱导细胞凋亡（图 2c）。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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