附子理中丸对脾阳虚大鼠海马、下丘脑和小肠cAMP-PKA通路的影响研究

发布时间：2020-05-19 08:48

【摘要】：目的:本文应用行为学和分子生物学等方法,观察了脾阳虚证模型大鼠海马、下丘脑、小肠组织线粒体超微结构与能量代谢相关的信号通路的变化,以及附子理中丸干预的效果。旨为阐明脾阳虚证“脾失健运”的生物学机制,以及该复方“温中健脾”功效的科学内涵提供实验依据。材料与方法:1.动物分组:SPF级Wistar雄性大鼠60只,7-8周龄,体重200g±10g,适应性饲养一周后,按体质量分层后,采用随机数字法随机分为4组:空白对照组(空白组)、脾阳虚模型组(模型组)、脾阳虚+附子理中丸组(中药组)、脾阳虚自然恢复组(恢复组),每组15只。2.模型建立:空白组不施加任何干预因素。模型组:采用饮食失节+劳倦等复合因素方法复制脾气虚模型。在此基础上,应用“苦寒泻下”法复制脾阳虚模型。中药组和恢复组按模型组方法复制动物模型。3.模型评价:拟定脾阳虚证模型大鼠类人宏观表证:主症:消瘦—体质量下降,神疲—运动能力下降和行为学变化,乏力—双前肢拉力下降,形寒肢冷—肛温下降,便溏—粪便含水率增加次症:食少—进食量减少,毛色枯槁无华评价标准:于动物模型复制第28d,通过对体质量、肛温、进食量、粪便含水率、运动能力和行为、双前肢拉力等变化的差异性比较,半定量评价动物模型复制是否成功,对不符合评价标准的实验动物予以剔除。4.药物干预:在模型建立后,中药组给予附子理中丸1:1水溶液灌胃,给药量为2m L/100g·d,给药14d。空白组和恢复组大鼠给予等量37℃生理盐水灌胃,模型组和中药组同时继续施加脾阳虚造模干预因素。各组大鼠均于实验的43d处死取材。5.一般状态检测:分别于造模结束后及药物干预后,常规方法测量体质量、肛温;代谢笼中方法检测24h进食、水量、粪便含水率等。6.行为学检测:分别于造模结束后及药物干预后,采用Open Field test(旷场实验法)进行检测、分析直立次数、运动距离、运动时间、平均运动速度(运动距离/运动时间)、活动区域等变化。7.双前肢抓力检测:采用抓力测定仪进行测定,每只大鼠连续检测三次,取平均值。8.电镜检测小肠黏膜上皮细胞、海马及下丘脑组织神经元线粒体超微结构的变化。9.ELISA法检测小肠、海马、下丘脑组织中β-EP、cAMP和PKA含量变化。10.放射免疫法检测小肠组织中ATP含量的变化。11.免疫组化SP法检测小肠、海马、下丘脑组织中β-内啡肽μ受体的表达变化。12.RT-PCR法检测小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1和线粒体UCP2蛋白mRNA的表达变化。13.Western blotting法检测小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1和线粒体UCP2蛋白的表达变化。14.化学荧光法检测海马和下丘脑组织中ROS含量变化。15.统计分析:所有数据均采用(?)±S表示,应用SPSS19.0统计软件进行数据分析。组间差异性检验采用单因素方差分析法或秩和检验法进行统计分析。结果:1.与空白组比较,模型组大鼠体质量、进食量、肛温明显下降(P均0.01),粪便含水率明显升高(P0.01),直立次数、运动距离、运动时间、平均运动速度和双前肢拉力明显低于空白组(P均0.01);与模型组比较,中药组大鼠体质量和进食量呈现明显上升(P均0.01),粪便含水率降低(P0.01),直立次数、运动距离、平均运动速度和双前肢拉力明显高于模型组(P均0.01),脾阳虚证类人宏观表征明显改善;恢复组大鼠上述指标变化与模型组比较无统计学差异。2.与空白组比较,模型组大鼠小肠黏膜上皮细胞、海马和下丘脑神经元细胞线粒体超微结构明显损伤,线粒体减少、肿胀,线粒体嵴肿胀断裂,空泡化;与模型组比较,中药组大鼠小肠黏膜上皮细胞、海马和下丘脑神经元细胞线粒体超微结构损伤程度减轻,线粒体形态结构相对完整,线粒体嵴排列规则,肿胀、断裂和空泡化减少;恢复组大鼠上述组织细胞线粒体超微结构变化与模型组相同。3.与空白组比较,模型组和恢复组大鼠小肠组织中ATP含量显著降低(P均0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠组织中ATP含量升高(P0.01);与中药组比较,恢复组大鼠小肠组织中ATP含量显著降低(P0.01)。4.与空白组比较,模型组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中β-EP含量和μ受体表达明显升高(P均0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中β-EP含量和μ受体表达降低(P0.05或P0.01);恢复组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中β-EP含量和μ受体表达与模型组比较无统计学差异。5.与空白组比较,模型组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中cAMP和PKA含量明显降低(P均0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中cAMP和PKA含量明显升高(P0.05或P0.01);恢复组大鼠小肠、海马和下丘脑组织中cAMP和PKA含量低于中药组(P0.05或P0.01)。6.与空白组比较,模型组、中药组、恢复组大鼠海马和下丘脑组织中ROS含量显著升高(P均0.01);与模型组比较,中药组大鼠海马和下丘脑组织中ROS含量显著降低(P均0.01);与中药组比较,恢复组大鼠海马和下丘脑组织中ROS含量高于中药组(P均0.01)7.与空白组比较,模型组大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1 mRNA表达明显降低(P均0.01),线粒体UCP2 mRNA表达明显升高(P0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1 mRNA表达明显上升(P均0.01),线粒体UCP2mRNA表达明显降低(P0.01);与中药组比较,恢复组大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1 mRNA表达降低(P0.05或P0.01),线粒体UCP2 mRNA表达升高(P0.05)。8.与空白组比较,模型组大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1蛋白表达明显降低(P均0.01),线粒体UCP2蛋白表达明显升高(P0.01);与模型组比较,中药组大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1蛋白表达上升(P均0.05),线粒体UCP2蛋白表达明显降低(P0.01);与中药组比较,恢复组大鼠小肠黏膜上皮细胞中CREB、Sirt1蛋白表达降低(P0.05或P0.01),线粒体UCP2蛋白表达升高(P0.05)。结论:1.脾阳虚证模型大鼠中枢及小肠上皮细胞线粒体超微结构明显损伤,附子理中丸能够不同程度逆转其损伤。2.脾阳虚证模型大鼠中枢及小肠上皮细胞β-EP-cAMP-PKA信号通路活动抑制,附子理中丸能够逆转此异常变化。3.脾阳虚证模型大鼠小肠上皮细胞中CREB、Sirt1 mRNA与蛋白表达明显下调,而线粒体UCP2表达上调;附子理中丸能够使其逆转。4.脾阳虚证模型大鼠海马、下丘脑组织ROS含量升高,小肠组织中ATP含量下降;附子理中丸能够降低海马、下丘脑组织ROS,提高小肠组织ATP含量。5.附子理中丸“温中健脾”的作用机制,可能参与了中枢神经元线粒体超微结构保护,提高β-EP-cAMP-PKA信号通路活动,促进中枢及小肠组织细胞线粒体能量代谢过程。
【图文】：

变化情况图,体质量,大鼠,变化情况

（P 均＞0.05）；②第 42d 与空白组比较，模型组、中药组降（P 均＜0.01）；③第 42d 与模型组比较，中药组和恢复P 均＜0.01）；④第 42d 与中药组比较，恢复组大鼠体质量表1-1 各组大鼠体质量变化（ X ±S）别 N体质量（g）第 1d 第 42d组 10 199.07±6.50 341.40±9.18组 10 198.43±6.44 171.07±4.06*组 10 199.39±4.07 236.64±8.14*组 10 199.47±6.04 217.30±7.90*组：**P＜0.01；vs.模型组：＃＃P＜0.01；vs.中药组：△△P＜0.01。

变化情况图,肛温,大鼠,进食量

△△P＜0.01。图1-2 第42d各组大鼠肛温变化情况比较3．各组大鼠进食量的变化四组大鼠的进食量变化情况见表 1-3、图 1-3。结果表明：①第 1d 四组大鼠进食量组间比较无差异（P 均＞0.05）；②第 42d 与空白组比较，模型组、中药组和恢复组进食量明显下降（P 均＜0.01）；③第 42d 与模型组比较，中药组进食量呈现上升趋势，但无统计学意义（P＞0.05）；恢复组进食量与模型组比较无统计学差异（P＞0.05）；④第 42d 与中药组比较，恢复组进食量低于中药组，，但无统计学意义（P＞0.05）。
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5

【相似文献】