【摘要】：目的:在体外细胞培养条件下,观察稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化自噬和凋亡相关蛋白、基因表达的影响,从分子生物学角度探讨稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化自噬和凋亡途径调控的作用机制,进一步揭示稳斑汤防治动脉粥样硬化的作用机制,从而为稳斑汤的临床应用提供科学的理论依据,丰富风痰理论的科学内涵。材料与方法:将20只SD大鼠按体重随机分为4组,空白组及稳斑汤低、中、高浓度组各5只。稳斑汤低、中、高浓度组分别予低、中、高浓度稳斑汤4.275g/kg、8.55g/kg、17.1g/kg灌胃,空白组给予等体积的蒸馏水灌胃,均连续灌胃7天,每天1次。在灌胃第8天,给药2小时后,腹主动脉取血,离心后分离血清。将小鼠巨噬细胞进行传代培养、冷冻及复苏,分为空白对照组,模型组,雷帕霉素组,稳斑汤低、中、高浓度组,除空白对照组外其余各组对巨噬细胞进行泡沫化干预,干预后空白对照组、模型组用10%大鼠空白血清与细胞共同培养48h;雷帕霉素组用雷帕霉素(终浓度10nmol/l)与细胞共同培养48h;稳斑汤低、中、高浓度组分别用10%稳斑汤低、中、高浓度含药血清与细胞共同培养48h,收集细胞后进行相关指标的检测。透射电镜下观察各组细胞超微结构自噬体;采用MTT法检测各组细胞的增殖活性;采用流式细胞术检测各组细胞的凋亡率;采用Western Blot及免疫荧光检测各组细胞自噬和凋亡相关蛋白LC3B、BECLIN1、MTOR、BAX、BCL2、CASPASE3的表达水平;采用RT-PCR检测各组细胞自噬和凋亡相关基因Lc3b、Beclin1、Mtor、Bax、Bcl2、Caspase3的表达水平。结果:1透射电镜下观察各组细胞超微结构自噬体空白对照组无明显自噬体出现;模型组可见少量自噬体出现,自噬体呈双层膜的囊泡状结构,包裹有内容物;稳斑汤各浓度组均可见较多自噬体出现,自噬体数量均高于模型组;雷帕霉素组也可见较多自噬体出现,自噬体数量高于稳斑汤各浓度组。2 MTT法检测各组细胞的增殖活性与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组的OD值均显著降低(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组的OD值均显著升高(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组的OD值均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组的OD值无明显差异(P0.05)。3流式细胞术检测各组细胞的凋亡率与空白对照组比较,模型组与稳斑汤低、中浓度组的细胞凋亡率均显著升高(P0.01),雷帕霉素组与稳斑汤高浓度组均无明显差异(P0.05);与模型组比较,稳斑汤高浓度组的细胞凋亡率有所降低(P0.05),雷帕霉素组显著降低(P0.01),稳斑汤低、中浓度组均无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤中浓度组的细胞凋亡率有所升高(P0.05),稳斑汤低浓度组显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。4 Western Blot检测各组细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达水平4.1各组细胞LC3B的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组LC3B的蛋白表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组均显著升高(P0.01);与模型组比较,稳斑汤低浓度组LC3B的蛋白表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组均显著升高(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组LC3B的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。4.2各组细胞BECLIN1的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组BECLIN1的蛋白表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组BECLIN1的蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组BECLIN1的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。4.3各组细胞MTOR的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组MTOR的蛋白表达水平有所降低(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组均显著降低(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组MTOR的蛋白表达水平均显著降低(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组MTOR的蛋白表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。4.4各组细胞BAX的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组BAX的蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组BAX的蛋白表达水平均显著降低(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组BAX的蛋白表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。4.5各组细胞BCL2的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组BCL2的蛋白表达水平均显著降低(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组BCL2的蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤高浓度组的BCL2的蛋白表达水平有所降低(P0.05),稳斑汤低、中浓度组均显著降低(P0.01)。4.6各组细胞CASPASE3的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组CASPASE3的蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组CASPASE3的蛋白表达水平均显著降低(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤高浓度组CASPASE3的蛋白表达水平有所升高(P0.05),稳斑汤低、中浓度组均显著升高(P0.01)。5免疫荧光检测各组细胞自噬和凋亡相关蛋白的表达水平5.1各组细胞LC3B的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组LC3B的蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,稳斑汤中浓度组LC3B的蛋白表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤高浓度组均显著升高(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤中浓度组LC3B的蛋白表达水平有所降低(P0.05),稳斑汤低浓度组显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。5.2各组细胞BECLIN1的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组BECLIN1的蛋白表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组均显著升高(P0.01);与模型组比较,稳斑汤中浓度组BECLIN1的蛋白表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤高浓度组均显著升高(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组BECLIN1的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。5.3各组细胞MTOR的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组MTOR的蛋白表达水平有所降低(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组均显著降低(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组MTOR的蛋白表达水平均显著降低(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组MTOR的蛋白表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。5.4各组细胞BAX的蛋白表达水平与空白对照组比较,稳斑汤高浓度组BAX的蛋白表达水平有所升高(P0.05),模型组与稳斑汤低、中浓度组均显著升高(P0.01),雷帕霉素组无明显差异(P0.05);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组BAX的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组BAX的蛋白表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。5.5各组细胞BCL2的蛋白表达水平与空白对照组比较,模型组与稳斑汤低、中浓度组BCL2的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),雷帕霉素组与稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组BCL2的蛋白表达水平均显著升高(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组BCL2的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。5.6各组细胞CASPASE3的蛋白表达水平与空白对照组比较,雷帕霉素组CASPASE3的蛋白表达水平有所升高(P0.05),模型组与稳斑汤各浓度组均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组CASPASE3的蛋白表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤中浓度组CASPASE3的蛋白表达水平有所升高(P0.05),稳斑汤低浓度组显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。6 RT-PCR检测各组细胞自噬和凋亡相关基因的表达水平6.1各组细胞Lc3b的m RNA表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Lc3b的m RNA表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组Lc3b的m RNA表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组Lc3b的m RNA表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。6.2各组细胞Beclin1的m RNA表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组及稳斑汤各浓度组Beclin1的m RNA表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组Beclin1的m RNA表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组Beclin1的m RNA表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。6.3各组细胞Mtor的m RNA表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Mtor的m RNA表达水平均显著降低(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组Mtor的m RNA表达水平均显著降低(P0.01),稳斑汤低浓度组无明显差异(P0.05);与雷帕霉素组比较,稳斑汤低、中浓度组Mtor的m RNA表达水平均显著升高(P0.01),稳斑汤高浓度组无明显差异(P0.05)。6.4各组细胞Bax的mRNA表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Bax的m RNA表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Bax的m RNA表达水平均显著降低(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤高浓度组Bax的m RNA表达水平有所升高(P0.05),稳斑汤低、中浓度组显著升高(P0.01)。6.5各组细胞Bcl2的m RNA表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Bcl2的m RNA表达水平均显著降低(P0.01);与模型组比较,稳斑汤低浓度组Bcl2的m RNA表达水平有所升高(P0.05),雷帕霉素组与稳斑汤中、高浓度组均显著升高(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤各浓度组Bcl2的m RNA表达水平均显著降低(P0.01)。6.6各组细胞Caspase3的m RNA表达水平与空白对照组比较,模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Caspase3的m RNA表达水平均显著升高(P0.01);与模型组比较,雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组Caspase3的m RNA表达水平均显著降低(P0.01);与雷帕霉素组比较,稳斑汤各浓度组Caspase3的m RNA表达水平均显著升高(P0.01)。结论:1稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化具有促自噬和抗凋亡作用。2稳斑汤含药血清通过调控巨噬细胞泡沫化自噬和凋亡相关蛋白和基因的表达来发挥其促自噬和抗凋亡作用,这可能是稳斑汤防治动脉粥样硬化的作用机制之一。
【图文】：
稳斑汤高浓度组（电镜，×20000 倍）雷帕霉素组（电镜，×20000 倍）注：箭头所示为自噬体图 1-1 各组细胞超微结构自噬体的电镜照片 MTT 法检测各组细胞的增殖活性与空白对照组比较，模型组、雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组的 OD 值均显著降P<0.01）；与模型组比较，雷帕霉素组与稳斑汤各浓度组的OD值均显著升高（P<0.01雷帕霉素组比较，稳斑汤低、中浓度组的 OD 值均显著降低（P<0.01），稳斑汤高组的 OD 值无明显差异（P>0.05）。结果见表 1-1，图 1-2。表 1-1 各组细胞的增殖活性情况（x ±s）组别 n OD 值空白对照组 6模型组 6雷帕霉素组 60.952±0.0910.538±0.065★★0.804±0.082★★☆☆
图 1-2 各组细胞增殖活性柱形图术检测各组细胞的凋亡率对照组比较，模型组与稳斑汤低、中浓度组的细胞凋亡率均显著，雷帕霉素组与稳斑汤高浓度组均无明显差异（P>0.05）；与模度组的细胞凋亡率有所降低（P<0.05），雷帕霉素组显著降低（浓度组均无明显差异（P>0.05）；与雷帕霉素组比较，稳斑汤中所升高（P<0.05），稳斑汤低浓度组显著升高（P<0.01），稳斑汤P>0.05）。结果见表 1-2，图 1-3，图 1-4。表 1-2 各组细胞凋亡率情况（X—±S）（%） n 细胞凋亡率组 33组 330.353±2.36764.450±8.161★★38.113±15.277☆☆
【学位授予单位】：辽宁中医药大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【相似文献】
相关期刊论文 前10条
1 牟婕;冯文静;王珊;冯美苹;毛拥军;;自噬调控衰老的研究进展[J];中华老年多器官疾病杂志;2019年01期
2 李黎;季漪;李文婷;马艳霞;李沐涵;吴勉华;;基于细胞自噬的中医药抗肿瘤作用研究进展[J];中华中医药杂志;2019年01期
3 韩苏夏;蔡梦娇;;自噬在肿瘤治疗策略中的角色[J];西部医学;2018年09期
4 周岐鸣;刘洋;季光;宋海燕;;调节自噬改善非酒精性脂肪性肝病的药物研究进展[J];中华中医药学刊;2018年10期
5 李晓琼;何玲玲;李新毅;;自噬与中枢神经系统退行性疾病研究进展[J];中风与神经疾病杂志;2018年10期
6 马文科;戴舒惠;罗鹏;杨悦凡;费舟;;线粒体自噬的研究进展[J];现代生物医学进展;2017年06期
7 付婉;董笛;赵颖;;自噬的相关分子机制[J];中国生物化学与分子生物学报;2017年05期
8 方聪聪;毛善平;董慧敏;刘宝辉;王舜;;线粒体自噬与中枢神经系统疾病关系的研究进展[J];卒中与神经疾病;2017年02期
9 李旭卉;吴习习;张凯;罗海霞;李敏;;线粒体自噬与癌症关系的研究进展[J];动物医学进展;2017年09期
10 陈延斌;黄建安;;自噬在呼吸系统的研究现状[J];中国呼吸与危重监护杂志;2017年06期
相关会议论文 前10条
1 肖伊宁;吕佩源;;选择性自噬的研究进展[A];7th中华医学会神经病学分会全国中青年神经病学学术大会暨第十届全国神经系统感染性疾病与脑脊液细胞学学术大会论文汇编[C];2014年
2 胡成枫;胡春兰;陈良标;;自噬在斑马鱼细胞冷应激过程中的作用机制探究[A];2017年中国水产学会学术年会论文摘要集[C];2017年
3 肖伊宁;吕佩源;;选择性自噬的研究进展[A];中华医学会第十七次全国神经病学学术会议论文汇编（下）[C];2014年
4 秦正红;粱中琴;陶陆阳;黄强;刘春风;蒋星红;倪宏;邢春根;;自噬在细胞生存与死亡中的作用[A];中国药理学会第九次全国会员代表大会暨全国药理学术会议论文集[C];2007年
5 秦正红;;自噬与肿瘤和神经细胞生存——药物作用的新靶位[A];全国生化与分子药理学药物靶点研讨会论文摘要集[C];2008年
6 余慧芬;唐李;李妍;;自噬现象对肿瘤发生影响的研究进展[A];2017第七届泛环渤海生物化学与分子生物学会学术交流会论文集[C];2017年
7 王菲菲;邱学敏;王凌;;自噬对骨代谢的调节作用[A];第9届中国中西医结合学会妇产科专业委员会第二次学术会议论文集[C];2017年
8 申森森;李林楠;徐林楠;白玉;刘虎威;;基于气相色谱-高分辨质谱的饥饿诱导小鼠胚胎成纤维细胞自噬过程的代谢组学研究[A];第21届全国色谱学术报告会及仪器展览会会议论文集[C];2017年
9 任栓成;倪娜娜;胡志安;;睡眠觉醒期神经元自噬活动的变化[A];中国睡眠研究会第九届学术年会汇编[C];2016年
10 蒋绪顺;;自噬在棕榈酸诱导的足细胞凋亡中的作用及机制[A];2016年中国中西医结合学会肾脏疾病专业委员会学术年会论文摘要汇编[C];2016年
相关重要报纸文章 前10条
1 记者 李洁尉 通讯员 周飞;花榈木通过“自噬”杀死癌细胞[N];科学时报;2011年
2 王建新 主持;“自噬”的快车刚刚启动[N];医药经济报;2016年
3 记者 周洁;解密“自噬”，，抗癌治病更近一步[N];河北日报;2016年
4 记者 陆琦 见习记者 谷双双;细菌通过诱导线粒体自噬求存活[N];中国科学报;2019年
5 本报记者 房琳琳;“自噬机制”带来对抗衰老新希望[N];科技日报;2016年
6 生命学院;俞立课题组在《科学》发文揭示自噬调控的重要机制[N];新清华;2012年
7 本报实习生 刘如楠 记者 李晨阳;最新研究揭秘植物是怎样衰老的[N];中国科学报;2019年
8 本报首席记者 唐闻佳;上海与新科诺奖得主颇有学术缘[N];文汇报;2016年
9 记者 陶婷婷;成功揭示代谢降解调控新机制[N];上海科技报;2013年
10 记者 白毅;浙大二院发现大气颗粒污染诱导呼吸道自噬性损伤新机制[N];中国医药报;2015年
相关博士学位论文 前10条
1 李波;抑制COX-2和自噬对肝癌细胞增殖及凋亡的影响[D];兰州大学;2013年
2 朱汉华;miRNA-323-3p靶向Pim1调控的自噬与凋亡在冠状动脉微栓塞致心肌损伤中的作用及机制研究[D];广西医科大学;2019年
3 赵殿臣;稳斑汤含药血清对巨噬细胞泡沫化自噬和凋亡途径调控作用机制的实验研究[D];辽宁中医药大学;2018年
4 孙兰弟;基于提高亲电性的策略设计天然导向的抗炎试剂和自噬激活剂及其作用机制研究[D];兰州大学;2015年
5 杨烽;Klotho对糖尿病肾脏病中细胞自噬作用的影响及其机制研究[D];南方医科大学;2018年
6 曹文婷;miR-125b-5p在UVB影响SLE自噬中的作用机制[D];昆明医科大学;2018年
7 孙晓琪;雌二醇通过G蛋白偶联雌激素受体30 (GPR30)/ERK1/2信号通路调节MC3T3-E1细胞线粒体自噬的分子机制研究[D];中国医科大学;2018年
8 刘永一;自噬在棕榈酸诱导骨髓间充质干细胞凋亡中的作用及机制研究[D];中国医科大学;2018年
9 陈树东;慢性颈脊毮压迫的临床转归及自噬在脊毮运动神经元中的作用[D];广州中医药大学;2016年
10 魏仪;自噬在环境内分泌干扰物致睾丸发育异常和功能障碍中的作用及机制研究[D];重庆医科大学;2018年
相关硕士学位论文 前10条
1 刘岩林;油菜、蜀葵等植物花粉母细胞自噬现象鉴定及自噬基因Atg8的克隆分析[D];兰州大学;2013年
2 宋洁;自噬在异丙肾上腺素诱导的H9c2心肌细胞肥大中的作用及青藤碱的干预作用[D];浙江工业大学;2018年
3 刘雨霞;外源性H_2S对缺血再灌注后神经元线粒体损伤的影响及其相关信号通路研究[D];贵州医科大学;2019年
4 郑璐;内质网应激诱导的自噬在肝细胞凋亡中的作用研究[D];贵州医科大学;2019年
5 张玉;酵母Whi2对细胞自噬的影响[D];苏州大学;2018年
6 杨鹏;microRNA-24通过自噬途径影响人脐静脉内皮细胞管腔形成的机制研究[D];广西医科大学;2018年
7 吴习习;NOD2在绵羊肺炎支原体诱导巨噬细胞自噬中的作用机制[D];宁夏大学;2018年
8 何燕;HBXIP介导的自噬调控及抗菌机制的研究[D];杭州师范大学;2018年
9 李景峰;昆虫自噬途径与杆状病毒AcMNPV侵染关系初探[D];西北农林科技大学;2018年
10 崔媛旭;高ACAC通过自噬诱导过量NETs引发机体免疫抑制的机制研究[D];吉林大学;2018年
本文编号：
2672130
