基于Nrf2-ARE信号通路研究仙鹤草活性组分改善IR的作用机制

发布时间：2020-05-20 05:44

【摘要】：糖尿病属于内分泌失调的代谢性疾病,主要伴随着糖耐量低、尿糖阳性以及持续高血糖症状等病理特征。目前,糖尿病主要分类为:I型糖尿病和II型糖尿病,其中II型糖尿病(T2DM)患者在所有糖尿病患者中所占比例高达90%以上,因此T2DM引起了国内外的广泛关注。胰岛素抵抗(IR)是导致T2DM的主要原因之一,而IR是由氧化应激通过多途径、多靶点作用于胰岛素信号传导通路所导致。以氧化应激信号通路为靶向途径,研发改善IR的药物对开发糖尿病新药具有重要意义。因此,本文在前期研究发现仙鹤草中活性组分黄酮(FC)和三萜(TC)具有抗氧化活性的基础上,将深入探讨FC和TC组分通过抗氧化途径达到缓解IR效果的具体机制,明确仙鹤草中的活性组分改善IR所涉及的具体途径以及信号通路,为开发仙鹤草活性组分作为抗糖尿病新药奠定基础。本文主要研究内容和结果如下:(1)通过高糖诱导人肝癌HepG2细胞建立稳定的体外IR模型。(1)采用含各浓度高糖培养液干预细胞,观察葡萄糖摄取情况。结果表明55 mM的干预组细胞对2-NBDG摄取荧光值(0.49)是所有高糖干预组中最低的,约为正常对照组的二分之一。在糖消耗实验中,干预后12h内,高糖(55 mM)干预组与正常对照组糖消耗量分别为1.65和4.12 mM,二者存在极显著差异。干预后24h内,二者糖耗量分别为6.38、3.5 mM,仍存在显著性差异。可确定建模最优条件为高糖(55 mM)培养液干预24h,且该模型在24h内可保持稳定的IR状态。(2)细胞中ROS水平测定结果表明,高糖(55 mM)干预组平均荧光值显著高于其余各组。可知IR模型中的ROS含量显著升高,表明胰岛素抵抗人肝癌细胞(IR-HepG2)中氧化应激水平升高。(2)研究了仙鹤草活性组分FC和TC对IR-HepG2细胞糖代谢的影响。(1)当FC和TC浓度为2.5μg/mL时,通过归一化法计算出FC和TC组平均摄取荧光值分别0.84和0.75,与模型组(0.51)相比较,二者的平均摄取荧光值分别提高了33%和24%,有显著性差异(p0.05),表明二者均能改善IR细胞对2-NBDG的摄取情况。(2)FC和TC浓度为2.5μg/mL时,其糖耗量分别为5.69和5.17 mM,此时正常对照组和模型组糖耗量分别为6.43和3.45mM。与模型组比较,FC和TC组的糖耗量显著升高。上述结果表明当FC和TC在一定浓度下可显著改善IR细胞中的糖代谢情况。(3)应用生物化学法和q-PCR技术研究了仙鹤草活性组分FC和TC对IR-HepG2细胞氧化应激的影响。(1)IR模型细胞中ROS含量随着FC、TC浓度的升高而逐渐降低。当FC和TC组分的干预浓度为2.5μg/m L时,评估ROS含量的平均荧光值分别为80403.3、107841.6,正常对照组和模型组分别为76767.1、142026.8,此时与模型组比较,FC和TC干预组细胞中ROS含量显著降低。研究还发现FC和TC组分对氧化性损伤标志物MDA有相似的调控作用。此外,二者除了均能有效降低细胞中ROS和MDA含量,同时还能增强超氧化物歧化酶SOD的活性。(2)抗氧化因子Nrf2mRNA的相对表达随FC、TC组分浓度的增加而升高。当FC和TC组分浓度为2.5μg/m L时,对Nrf2 m RNA的相对表达具有显著的上调作用。(3)GSH-PX、NQO1,HO-1和γ-GCS抗氧化酶基因mRNA的相对表达随FC和TC浓度的升高而升高。与模型组比较,FC和TC组分浓度为2.5μg/m L时,二者对四个抗氧化酶基因mRNA的表达均表现出显著的上调作用。以上结果表明仙鹤草活性组分FC和TC可通过激活Nrf2-ARE抗氧化信号通路从而启动下游抗氧化酶基因的表达,最终达到改善IR模型细胞中氧化应激的作用。(4)应用q-PCR和Western blotting技术研究了仙鹤草活性组分FC和TC对IR-HepG2细胞中JNK和IRS-1/PI3K/Akt信号途径的调控作用。(1)JNK mRNA的表达量随着FC和TC的浓度的升高而降低。FC组分浓度为2.5μg/m L时,与模型组比较,FC干预组中JNK mRNA的相对表达量显著降低(P0.05)。(2)IRS-1 mRNA的相对表达量与FC和TC组分浓度呈现剂量依赖性升高。FC和TC组分的浓度为2.5μg/mL时,与模型组比较,FC和TC干预组中IRS-1 mRNA的相对表达量显著升高(P0.01);同样,二者对Akt mRNA的相对表达量有着相似的调控作用。(3)与正常对照组比较,模型组中JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化和IRS-1ser307磷酸化水平均显著升高。FC和TC组分浓度为2.5μg/mL时,与模型组相比较FC和TC干预组中JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化和IRS-1ser307磷酸化水平显著降低。以上结果表明FC和TC组分在一定浓度下可通过下调JNK mRNA的表达和降低JNK(Thr183/Tyr185)磷酸化水平从而上调IRS-1 mRNA的表达和降低IRS-1ser307磷酸化水平,使胰岛素信号回归正常的传导,最终达到改善IR的作用。
【图文】：

技术路线图,技术路线,信号通路

③ 基于 Nrf2-ARE 信号通路，研究仙鹤草活性组分 FC 和 TC 对 IR-HepG2 细胞中氧化应激的影响。药物干预后，检测细胞中 ROS 和 MDA 水平、抗氧化酶 SOD活性，同时还检测氧化应激信号通路中关键因子 Nrf2 的 mRNA 相对表达情况以及Nrf2-ARE 信号通路下游抗氧化酶基因 NAD(P)H:醌氧化还原酶(NQO1)、谷胱甘肽过氧化物酶 GSH-Px、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS) 和血红素氧合酶-1(HO-1)转录水平情况。明确 FC 和 TC 是否可以通过这些靶点及抗氧化途径来改善 IR，，阐明 Nrf2-ARE 信号通路在 FC、TC 组分改善 IR- HepG2 细胞氧化应激中的重要性；④ 研究仙鹤草活性组分 FC 和TC 对 IR-HepG2 细胞中JNK和 IRS-1/PI3K/Akt信号通路的调控作用。应用 q-PCR 和Western blotting技术分别检测 FC 和TC 对IR-HepG2 细胞中 JNK 以及 IRS-1/PI3K/Akt 信号传导通路中重要基因 mRNA 的相对表达情况、关键蛋白表达水平和磷酸化情况的调控，阐明 FC、TC 组分通过改善 IR-HepG2 细胞氧化应激状态进而改善 IR 的网络调控关系。1.3 技术路线

细胞,糖含量,培养液,组间

注：与 5.5 mM 组比较*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001，n=图 2.1 细胞对 2-NBDG 摄取的相对荧光值Fig. 2.1 The relative fluorescence values of 2-NBDG uptake in cells浓度高糖培养液对 HepG2 细胞糖消耗的影响萄糖摄取实验，说明高糖（55mM）能诱导 HepG2 细胞建步检测 IR 模型的稳定性，运用葡萄糖氧化酶法检测高糖干消耗情况。不同浓度高糖 25mM、35mM、45mM、55mM每组换上含 25mM 葡萄糖的培养液，孵育 12h，通过葡萄糖液中葡萄糖含量，利用空白对照组上清中的糖含量减去各含量，得到葡萄糖消耗实验结果如图 2.2，可以看出随着培高，葡萄糖消耗量逐渐降低。与低糖培养液干预组（5.5m萄糖含量在 35mM 时，与低糖培养液组间均存在显著差异液葡萄糖浓度为 45mM 和 55mM 时，与低糖培养液组间均.001）。从图中还可看出当培养液中糖含量为 55mM 时糖耗
【学位授予单位】：重庆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285

【相似文献】