鸡豆黄素A对血管紧张素Ⅱ诱导多巴胺能神经元损伤的保护作用及其机制的研究

发布时间：2020-05-23 05:19

【摘要】：帕金森病(parkinson's disease,PD)是一种常见的中枢神经系统退行性病变,其典型病变是在黑质致密部、蓝斑神经元,上述部位多巴胺(dopamine,DA)能神经元出现变性、凋亡、缺失。脑肾素-血管紧张素系统(RAS)在调节神经炎症反应和多巴胺能(DA)神经元退行性病变的进展中起重要作用。血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ,AngⅡ)通过血管紧张素Ⅱ-1型受体(AT1R)诱导小胶质细胞活化介导的神经炎症与PD的病程有密切的关系,从而影响DA能神经元的功能。Endophilin A2(EP2)参与快速内皮素介导的胞吞作用(FEME)并迅速内吞几种G蛋白偶联受体(GPCR),而AT1R属于GPCR家族,因此,EP2可能通过内吞AT1R调节小胶质细胞激活。鸡豆黄素A(biochanin A,Bioch A)是一种异黄酮类植物雌激素,课题组前期研究表明Bioch A可以抑制由于LPS诱导的小胶质细胞发生的活化,但AngII诱导的小胶质细胞发生激活,进而引起DA能神经元的凋亡,其作用还不明确。目的:研究Bioch A对AngⅡ诱导的DA能神经元损伤的改善作用及其机制。方法:采用随机分组法将SD大鼠分成以下6组:假手术组、AngⅡ(5μg/3μl)模型组、Losartan对照组和鸡豆黄素A不同浓度给药组(AngⅡ+Bioch A(16mg/kg)、AngⅡ+Bioch A(32mg/kg)、AngⅡ+Bioch A(64mg/kg))。用脑部立体定位仪精准定位在大鼠大脑黑质致密部处,注射AngⅡ引发DA能神经元的损伤状态从而制备模型,假手术组注射等体积生理盐水。注射后24h苏醒,Bioch A组按相应浓度梯度灌胃给药,Losartan组也灌胃给药。注射后第7天,各组大鼠开始观察各行为学指标的改变。接着,各组大鼠腹腔注射阿朴吗啡,检测并记录旋转圈数,实验结束后立即断头处死,取组织待检。采用免疫组织化学法(IHC-P),观察小胶质细胞的活化和DA能神经元的状态,Nod样受体热蛋白结构域相关蛋白3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)、Endophilin A2(EP2)。采用免疫蛋白印迹法(western blot),检测大脑黑质致密部α-突触蛋白(α-synuclein)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase-1,Caspase-1)、凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-associated speck-likeprotein containing CARD,ASC)、gp91phox、p22phox、IL-1β(interleukin1β,L-1β)、IL-6(interleukin-6)、IL-18(interleukin-18,IL-18)、TNF-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)表达情况。结果:1)对模型大鼠行为学影响结果:与假手术组相比,AngⅡ组大鼠的自由活动能力出现不同程度降低;与AngⅡ组相比,Bioch A组大鼠的自发活动及探索行为均有不同程度提高。2)诱导旋转结果:AngⅡ组大鼠腹腔注射阿扑吗啡出现向健康侧旋转的现象,且Bioch A组旋转次数少于AngⅡ组。3)对模型大鼠病理学影响:假手术组大鼠黑质致密部中DA能神经元饱满且数目多,小胶质细胞数量较少且大多数处于沉默状态;而AngⅡ组,DA能神经元大多形态发生变化最后凋亡、缺失,胞体萎缩,同时小胶质细胞激活明显增多,呈“阿米巴样”;与AngⅡ组相比,Bioch A组减少了小胶质细胞活化数量和降低DA能神经元损伤程度。4)对模型大鼠NLRP3炎症小体影响:AngⅡ组NLRP3蛋白表达升高,而Bioch A组降低了NLRP3表达量;Western blot观察结果:AngⅡ组Caspase-1和ASC蛋白表达量升高,Bioch A组显著降低Caspase-1和ASC蛋白表达水平。5)对模型大鼠氧化亚基的影响:AngⅡ组gp91phox和p22phox表达量升高,但Bioch A组降低了gp91phox和p22phox表达量。6)对模型大鼠炎症因子的影响:AngⅡ组IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α表达量升高,Bioch A组降低IL-1β、IL-6、IL-18、TNF-α。7)对模型大鼠吞蛋白和AT1R的影响:AngⅡ组EP2表达降低,AT1R表达升高,但Bioch A组促进EP2蛋白表达,降低AT1R表达水平。结论:Bioch A对AngⅡ诱导的DA能神经元损伤模型大鼠具有保护作用,其机制可能与Bioch A抑制AngII诱导小胶质细胞的活化,通过抑制NADPH氧化酶和NLRP3炎症小体的活性,其进一步机制可能与EP2和AT1R之间的相互作用有关。
【图文】：

自发活动,行为学,大鼠,统计学意义

5. 结果5.1 鸡豆黄素A对AngⅡ诱导的DA神经元损伤模型大鼠自发活动和行为学影响阿扑吗啡诱导旋转实验数据显示，与假手术组相比，AngⅡ组旋转数增多，差异具有统计学意义（p < 0.01）；与 AngⅡ组相比，Bioch A 给药组旋转数降低，差异具有统计学意义（p < 0.01 或 p < 0.05）。行为学指标显示，与假手术组相比，AngⅡ组大鼠实验时间内穿过虚拟网格数，运动轨迹长度和前肢离地数全都有所减少，差异具有统计学意义（p< 0.01 或 p < 0.05）;与 AngⅡ组相比，Bioch A组的运动轨迹长度和前肢离地数均有不同程度提高，且差异具有统计学意义（p < 0.01 或 p < 0.05）。提示 Bioch A 能改善 AngⅡ诱导的 DA 能神经元损伤模型大鼠的自发活动及探索行为能力，，如图 1 所示。

小胶质细胞,黑质致密部,活化的,大鼠

29图 2 鸡豆黄素 A 对 AngⅡ诱导的 DA 神经元损伤模型大鼠在黑质致密部小胶质细胞活化的影响（n=4）Fig.2 Effects of biochanin A on microglial activation in the SNpc of AngⅡ-inducedDA neuronal damage rats. Representative imagines showing Bioch A inhibitsmicroglial activation and morphological changes in the SNpc of AngⅡ-induced DAneuronal damage rats (immunohistochemistry) (a). The bar is 100 μm. A sham group;B AngⅡ group; C Losartan group; D, E, F Biochanin A (16, 32, 64 mg/kg) group.Quantitative analysis of Iba1 positive expression in the SNpc (b). Results areexpressed as means ± SD (n=4). **p<0.01 vs the sham group,△p<0.05,△△p<0.01 vsthe AngⅡ-treated group.
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285.5

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