【摘要】：第一部分丹参注射液对糖尿病大鼠模型肾脏局部肾素-血管紧张素系统(RAS)的影响目的:通过高糖高脂饲料联合小剂量链脲佐菌素(STZ)建立糖尿病大鼠模型,分别给予丹参注射液及二甲双胍进行干预,观察糖尿病大鼠的一般情况、生化指标、蛋白尿、肾功能、肾脏病理及肾脏组织血管紧张素II1型受体(AT1)与Mas的表达水平,探讨丹参注射液对糖尿病大鼠肾脏保护作用的机制。方法:40只健康雄性SD大鼠,采用STZ(50 mg/kg)腹腔注射联合高糖高脂饲料建立糖尿病大鼠模型,然后随机分为造模组、丹参注射液组、二甲双胍组,同时设置正常对照组。连续给药6周,每周记录体重与血糖变化。给药六周后,将大鼠置于清洁的代谢笼中收集尿液,检测24 h尿蛋白量;10%水合氯醛麻醉后,腹主动脉取血分离血清,用生化仪器检测血肌酐、尿素氮;取出大鼠肾脏称重后,经脱水、透明处理后用石蜡包埋。每个蜡块用石蜡切片机切成厚度为5μm的组织切片,用于HE染色与免疫组化检测。结果:连续给药6周后,与正常组相比,糖尿病模型大鼠的体重明显降低,相对肾重、血糖、24 h尿蛋白量、血肌酐、尿素氮均有显著增加。丹参注射液给药组可以显著降低24 h尿蛋白量、血肌酐与尿素氮的水平(P0.05)。肾脏组织HE染色结果表明,丹参注射液可以明显改善糖尿病大鼠的肾小球肥大,系膜细胞增生,基底膜增生与肾小管的萎缩。AT1和Mas主要分布在肾小管内,免疫组化结果显示与正常组相比,模型组的AT1表达量显著增加、Mas表达显著降低;丹参注射液给药组可以显著减少AT1表达,同时增加Mas表达。结论:丹参注射液可以有效改善糖尿病肾病大鼠肾小管病变、减少24 h尿蛋白量,血肌酐与尿素氮水平。丹参注射液可以抑制AT1的表达,同时使Mas蛋白表达增加,从而说明丹参注射液治疗糖尿病肾病可能是通过平衡ACE2-Ang(1-7)-Mas轴与ACE-AngⅡ-AT1轴。第二部分丹参注射液对高糖诱导NRK-52E细胞损伤的保护作用及AT1和Mas表达的影响目的:考察高糖对NRK-52E细胞AT1和Mas表达的影响及丹参注射液的干预作用,并研究PI3K在其中的作用。方法:(1)通过预实验确定丹参注射液的作用浓度,将该实验分为3组:正常对照组(NG,5.5 mmol/L葡萄糖);高糖模型组(HG,80 mmol/L葡萄糖);丹参组(240μg生药/m L丹参+80 mmol/L葡萄糖)。各组细胞孵育24 h,用倒置显微镜观察NRK-52E细胞形态,采用MTT法检测孵育不同时间(24、48、72 h)丹参注射液对高糖损伤细胞增殖的影响;同时采用免疫荧光检测细胞内PI3K、p-PI3K蛋白表达;Western Blot法检测AT1、Mas、PI3K和p-PI3K蛋白表达。(2)根据预实验,将该实验分为4组:正常对照组(NG,5.5 mmol/L葡萄糖);AngⅡ模型组(AngⅡ,10-5 mol/L);丹参注射液组(240μg生药/m L丹参+10-5 mol/L AngⅡ);氯沙坦组(10-5 mol/L氯沙坦+10-5 mol/L AngⅡ)。采用MTT法检测丹参注射液对AngⅡ损伤细胞增殖的影响;同时采用Western Blot法检测各组细胞内PI3K、p-PI3K蛋白表达的影响。结果:(1)MTT结果显示:(1)80 mmol/L的高糖培养基作用24 h、48 h、72 h可以显著抑制NRK-52E细胞的增殖(P0.01);(2)10-5 mol/L AngⅡ作用24 h可以显著抑制NRK-52E细胞的增殖(P0.01)。丹参注射液可以恢复高糖/AngⅡ引起的NRK-52E细胞数的减少(P0.01或P0.05);(2)免疫荧光检测结果显示:与正常组相比,高糖作用24 h后PI3K、p-PI3K蛋白表达明显升高。与高糖模型组相比,丹参注射液可以使PI3K、p-PI3K蛋白的表达减少。(3)Western blot结果显示:(1)与正常组相比,高糖作用24 h可以提高NRK-52E细胞中PI3K、p-PI3K、AT1蛋白的表达,同时减少Mas蛋白的表达(P0.01或P0.05)。与高糖模型组相比,丹参注射液组PI3K、p-PI3K蛋白的表达量显著下降,Mas蛋白显著上升(P0.01或P0.05),AT1蛋白表达虽有下降,但是没有显著性差异。(2)与正常组相比,高糖作用48 h可以减少NRK-52E细胞中PI3K、p-PI3K、Mas蛋白的表达(P0.01或P0.05),同时略有提高AT1蛋白的表达,但是没有显著性差异。与高糖模型组相比,丹参注射液组细胞中PI3K、p-PI3K、Mas蛋白的表达量显著增加,AT1蛋白的表达量下降(P0.01)。(3)与正常组相比,10-5 mol/L AngⅡ作用24 h可以减少NRK-52E细胞中PI3K、p-PI3K蛋白的表达。与AngⅡ模型组相比,丹参注射液组PI3K、p-PI3K蛋白的表达量显著增加(P0.01)。结论:高糖可以通过提高AT1表达,减少Mas表达激活肾小管细胞内肾素血管紧张素系统,丹参注射液可以抑制AT1表达,同时提高Mas表达,提示丹参注射液可能是通过平衡ACE2-Ang(1-7)-Mas与ACE-AngⅡ-AT1途径发挥作用,缓解由高糖诱导的NRK-52E细胞的损伤,并且这种作用与PI3K激活相关。
【图文】：
丹参注射液对糖尿病肾病大鼠体重的影响
18注：#P＜0.01 vs Normal group图 1.2 丹参注射液对糖尿病肾病大鼠相对肾重的影响。（n=6-8）Fig.1.2 Effect of danshen injection on comparison of kidney weight in DN rats.（n=6-8）.
【学位授予单位】：安徽中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R285.5
【参考文献】
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