白皮杉醇抑制胆固醇依赖型细胞溶素活性及作用机制

发布时间：2020-05-24 02:00

【摘要】：胆固醇依赖型细胞溶素(Cholesterol-dependent cytolysins,CDCs)是多种革兰氏阳性病原菌在感染过程中分泌的一大类毒素,其典型特征是能在靶细胞上打孔,裂解多种细胞,因此也被称为成孔毒素或溶血素。分泌CDCs的革兰氏阳性病原菌能引发人畜多种感染性疾病,如脑膜炎、菌血症、关节炎、肺炎、胃肠炎和坏死性肠炎等,严重威胁人类健康、畜牧业经济效益和食品安全。40多种革兰氏阳性病原菌能在感染过程中分泌CDCs,其中单增李斯特菌细胞溶素(Listeriolysin O,LLO)、猪链球菌细胞溶素(Suilysin,SLY)和肺炎链球菌细胞溶素(Pneumolysin,PLY)分别由单核增生李斯特菌(L.monocytogenes)、猪链球菌(S.suis)和肺炎链球菌(S.pneumonia)分泌,是CDCs家族中典型代表性成员。研究表明细胞溶素在其病原菌感染过程中发挥多方面关键作用,如裂解多种细胞,导致细胞内容物泄露;促进病原菌穿过血脑屏障,引发脑膜炎;帮助细菌逃避免疫系统清除作用;诱导细胞凋亡;降低机体免疫力,引发炎症等,这些重要作用使其成为筛选抗分泌CDCs革兰氏阳性病原菌抗菌剂的重要靶点。此外,研究表明CDCs家族成员一级结构有高度同源性、空间结构存在高度相似性、有相似的成孔机制和相近的生物学功能,这些共同特征也为以CDCs为靶标筛选广谱抗毒力抑制剂奠定了基础。本研究以CDCs家族中典型成员LLO、SLY和PLY为靶标,获得食源性天然化合物白皮杉醇抑制剂,抗菌试验表明白皮杉醇在有效抑制成孔活性浓度条件下不影响病原菌的生长;蛋白免疫印迹试验发现白皮杉醇能直接抑制CDCs寡聚体的形成。细胞水平上,白皮杉醇显著降低了分泌CDCs病原菌介导的细胞毒性及炎症反应。动物试验发现白皮杉醇对单增李斯特菌感染小鼠表现出了系统性的保护作用,体现在降低感染小鼠死亡率,降低单增李斯特菌靶器官(脾脏和肝脏)细菌定植数和炎症因子水平,缓解了炎症反应。基于计算生物学和生物化学方法探究并验证了白皮杉醇与CDCs作用机制。利用分子对接和分子动力学模拟方法获得了白皮杉醇与CDCs稳定复合物体系,分析了研究对象之间的具体结合模式、结合过程中氨基酸自由能贡献、蛋白质中各氨基酸残基在结合白皮杉醇前后柔性的变化及氢键作用,发现白皮杉醇结合在CDCs家族成员第2结构域与第4结构域的交界处,结合后引发CDCs空间构象发生变化,导致第2结构域与第4结构域之间的夹角变大,第4结构域不能充分与靶细胞膜上的胆固醇受体结合,阻碍了寡聚体的形成,引发了成孔活性的降低。天冬酰胺在白皮杉醇与CDCs成员蛋白的结合过程中贡献了能量,精氨酸和酪氨酸仅在白皮杉醇与PLY和SLY的结合过程发挥了作用。白皮杉醇与PLY和SLY的结合过程中存在氢键作用,整个结合过程中氢键的稳定性高于60%,表明氢键是SLY和PLY与白皮杉醇结合过程中重要分子间作用力,对复合物体系的稳定提供重要作用。另外通过Lig Plus软件和径向分布函数分析发现白皮杉醇的间位羟基是氢键形成的关键基团,最后通过氨基酸定点突变、荧光淬灭和突变后结合自由能计算确证了分子动力学模拟结果的可靠性和可信性。分子机制的探索和阐明为开发抗CDCs病原菌广谱抗菌剂提供了重要理论基础。
【图文】：

动物源大大增加了人感染的几率，显著增加了传染源及传播几率[38]感染主要表现为持续高热 41℃-43℃，精神萎靡，食欲不振，嗜睡等得不到适当控制，将迅速发展为脑膜炎、菌血症直至引发死亡[39]。猪链球菌感染呈世界范围内暴发，1954 年猪链球菌被发现为猪的病原 年，荷兰学者首次报道猪链球菌引发人感染并导致脑炎。大量调查世界范围内已经有 30 多个国家和地区暴发过猪链球菌的感染与流引发了约 1600 多人感染，并导致死亡案例发生[40]。北美的加拿大和的智利、阿根廷和法属圭亚那都有人感染猪链球菌的案例报道[40]。国家都暴发过人感染 2 型猪链球菌感染病例，如意大利、法国、德、希腊、荷兰、丹麦、葡萄牙等[41]。亚洲的泰国和越南也暴发过人菌病例且呈现出地方性特征[42]。2005 年和 1998 年中国四川暴发了人感染猪链球菌案例，数百人感染发病并导致数十人死亡，引起了球菌感染的高度重视[43]。

固醇依赖型细胞溶素与产气荚膜梭菌溶血素 PFO 的晶体结构进行了比对分析，发现它们之间有极高的相似性（图 1.2），在第三区域（domain 3, D3）都有一个包含两个明显 α-HBs（αHB1 和 αHB2）的 β-折叠二级结构，D3 位于 β-折叠中心的侧面，，但是它们的晶体结构也表现有两个显著的不同点，分别是：（1）第1-3 区域（domain 1-3，核心区域）和第 4 区域（domain 4，侧区）之间有一个明显的弯曲，也就是夹角，不同家族成员蛋白之间的夹角不同；（2）当家族蛋白晶体在空间出现彼此重叠时，高度保守的 11-氨基酸肽环结构不发生改变，这一点在 PFO 和 ALO 中尤为明显。正是由于这个高度保守的 11-氨基酸肽环结构不会形成 3D 空间构象，于是研究者推测这一序列在各个家族成员的一级结构也就是氨基酸序列中是高度保守的，后期研究发现，这些结构上的差异似乎并不是由于晶体结构在空间折叠相互接触引发的，很大的可能性是由于 11-氨基酸肽环结构中的氨基酸残基与邻近结构域的氨基酸残基产生了多种分子间作用力引发的[108]。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R285;Q939.92

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本文编号：2678288