基于Label Free与高通量测序技术对龟甲及其炮制品的质量研究

发布时间：2020-05-26 04:52

【摘要】：1研究目的龟甲为龟科动物乌龟Chinemys reevesii(Gray)的背甲及腹甲。药用历史悠久,应用广泛。龟甲多以龟甲饮片、醋制龟甲等形式入药,需求量大。动物类药材在炮制成饮片的过程中,其外在可视特征与内含化学成分均会产生很大变化,研究的难度也随之增加,相关报道较少。蛋白、氨基酸类成分为龟甲的主要药效物质,2015版《中国药典》仅规定对龟甲的性状、薄层色谱(TLC)进行鉴别,远远达不到对其质量进行控制的目的。为完善龟甲质量控制体系,本实验采用柱前衍生化AQC高效液相色谱法及非标记定量Label Free技术对龟甲及其炮制品的氨基酸、肽段、蛋白进行研究。采用柱前衍生化AQC-HPLC法对龟甲及其炮制品中的氨基酸进行测定,比较龟甲炮制前后氨基酸类成分在种类、含量上的变化。采用非标记定量Label Free技术,通过蛋白提取、还原烷基化和酶解、肽段定量、质谱检测、数据库搜索等,对龟甲及其炮制品进行蛋白组学分析,明确龟甲炮制前后的差异蛋白,对龟甲全蛋白进行功能注释,并对差异蛋白进行GO富集及Pathway富集分析;同时,本实验还聚焦当前备受关注的中药材微生物污染问题,采用形态观察、显微鉴定、DNA条形码技术3种方法结合高通量测序技术对龟甲及其炮制品表面真菌多样性进行研究,综合对比龟甲炮制前后表面真菌差异,为更好对龟甲进行质量安全评价提供依据。2研究内容与研究方法2.1样品收集分别从河北安国、安徽亳州、四川成都等药材市场及北京各大药店共收集17批生龟甲、17批醋龟甲。并按2015版《中国药典》中龟甲炮制方法,自制3批醋龟甲。2.2基于柱前衍生化AQC高效液相色谱法的龟甲及其炮制品中氨基酸类成分研究通过柱前衍生化AQC高效液相色谱法对龟甲及其炮制品进行多种氨基酸的含量测定,包括谷氨酸、甘氨酸、天冬氨酸等,分析龟甲炮制前后氨基酸的种类、含量的变化。2.3基于非标记定量Label Free技术的龟甲及其炮制品的蛋白组学研究采用非标记定量Label Free方法对龟甲及其炮制品进行蛋白组学研究,明确龟甲炮制前后的差异蛋白,对龟甲全蛋白进行功能注释,并对差异蛋白的GO富集及Pathway富集进行分析。2.4龟甲及其炮制品表面真菌的培养与鉴定无菌水洗脱龟甲及其炮制品表面真菌,采用平板法培养真菌。采用形态观察、显微鉴定、DNA条形码3种方法鉴定龟甲表面真菌。2.5基于高通量测序技术的龟甲及其炮制品表面真菌多样性研究基于Illumina HiSeq测序平台的高通量测序技术对龟甲及其炮制品表面真菌多样性进行研究。对龟甲表面真菌进行物种划分。3研究结果3.1通过对龟甲炮制前后所含氨基酸的种类及含量分析可知,龟甲生品的氨基酸总量和炮制品的氨基酸总量具有显著差异,生品的氨基酸总量高于炮制品。龟甲生品的氨基酸总量的含量范围为24.38～35.33%,平均含量为28.77%,;龟甲炮制品的氨基酸总量的含量范围为19.51～25.67%,平均含量为22.92%。龟甲生品和炮制品的共有氨基酸为15种,炮制品相比生品减少胱氨酸(Cys)、蛋氨酸(Tyr)2种氨基酸。在共有的15种氨基酸中,含量最高的三种氨基酸依次为甘氨酸、脯氨酸、谷氨酸,三种氨基酸在龟甲生品中平均含量分别为6.04%、3.04%、2.80%,在龟甲炮制品中平均含量为5.40%、2.65%、2.42%。龟甲生品与炮制品中所含各类氨基酸的含量高低趋势基本相同。3.2基于非标记定量Label Free技术对龟甲及其炮制品的蛋白组学进行研究,一共检索到179个肽段、55个蛋白。龟甲及其炮制品的蛋白分子量多集中在80KDa以下。龟甲生品和炮制品的相关系数范围在0.17～0.48,表明龟甲生品和炮制品之间在蛋白水平上的表达相似度具有一定差异。龟甲生品与炮制品的共有蛋白为30个,其中16个蛋白在炮制品中有较大程度的降解,14个蛋白无明显差异;龟甲生品中特有蛋白有23个,故龟甲生品与炮制品的差异蛋白共39个。对龟甲蛋白进行功能注释,经GO分析可知,龟甲的蛋白功能主要与细胞和生物代谢过程相关。对龟甲生品及其炮制品的差异蛋白进行GO富集分析,发现特异富集GO功能涉及氧化还原、单体分解代谢、一元羧酸代谢、有机物分解、磷酸核苷代谢、磷酸核糖代谢等多个细胞代谢过程;经KEGG Pathway分析可知,龟甲的蛋白功能主要涉及人类疾病、生物体系统等代谢途径。对龟甲生品及其炮制品的差异蛋白进行Pathway富集分析,发现特异富集KEGG Pathway涉及HIF-1信号、钙信号、细胞凋亡、阿尔茨海默病、系统性红斑狼疮等多条代谢通路。3.3通过对龟甲表面的真菌进行培养与鉴定,发现龟甲生品与炮制品表面真菌具有一定差异。数目上,生龟甲表面真菌数量多于醋龟甲;种类上,醋龟甲表面真菌种类多于生龟甲;生龟甲表面多为曲霉属真菌,醋龟甲表面曲霉属、青霉属真菌较多。生龟甲,醋龟甲表面均未检测到黄曲霉菌。3.4基于高通量测序技术对龟甲及其炮制品表面真菌多样性进行研究。通过评估各阶段样品的序列数目,序列长度,GC含量,Q20和Q30质量值,Effective等参数,表明测序数据的质量优,正确率高。同时综合衡量了各样品的ACE、Chao1、Simpson、Shannon等Alpha多样性指数,证明测序结果真实地反映了龟甲生品及炮制品表面真菌多样性情况。对龟甲及其炮制品表面真菌进行物种分类,龟甲生品及炮制品表面真菌主要由担子菌门及子囊菌门2个门的真菌组成。龟甲表面丰度较高的真菌包括曲霉属、孢子丝属、念珠菌属、毕赤酵母属、节担菌属、枝孢菌属、虫草属、黄萎病属及青霉属真菌。龟甲生品和炮制品表面真菌的组成具有一定差异。生品表面丰度最高的为曲霉属真菌,其次为孢子丝属真菌、念珠菌属真菌排第三。炮制品表面则主要由孢子丝属真菌与曲霉属真菌组成。4结论4.1柱前衍生化AQC高效液相色谱法能够对龟甲及其炮制品中的氨基酸进行定性定量测定,为更好对龟甲进行质量控制提供依据。4.2利用Label Free技术对龟甲及其炮制品进行蛋白组学相关内容的研究,可得到其差异蛋白及蛋白功能信息,能够为后续更深入挖掘龟甲药理活性奠定基础。4.3形态观察、显微鉴定、DNA条形码技术集合高通量测序能够全面地对龟甲及其炮制品表面真菌多样性进行研究。能够更好地对龟甲药材的质量安全进行评价,指导龟甲临床合理用药。5创新点首次采用非标记定量Label Free技术对龟甲及其炮制品进行蛋白组学研究。首次应用形态观察、显微鉴定、DNA条形码结合高通量测序技术综合评价龟甲表面真菌多样性。
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【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284

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