基于UPLC-ESI-Q-TOF-MS的芪仙清鸣颗粒的物质基础研究

发布时间：2020-05-28 09:38

【摘要】：芪仙清鸣颗粒处方来源于上海市普陀区中心医院的临床经验方,已有6年使用历史,由淫羊藿、黄芪、虎杖、巴戟天、枇杷叶、生地黄、川芎、旋覆花8味药材组成,具有治疗支气管哮喘的功效。本文以芪仙清鸣颗粒为研究对象,采用超高效液相色谱-电喷雾-四极杆飞行时间质谱(UPLC-ESI-Q-TOF-MS)进行化学成分表征及其在大鼠体内的移行成分分析,结合网络药理学方法,初步阐明了芪仙清鸣颗粒的整合调节机制,建立了芪仙清鸣颗粒的质量标准。1.芪仙清鸣颗粒全方化学成分辨识和表征首次建立芪仙清鸣颗粒的UPLC-ESI-Q-TOF-MS分析方法,基于分子量、碎片离子和保留时间,结合文献和由对照品裂解途径总结的裂解规律,在正负离子模式下,鉴定芪仙清鸣颗粒中的化学成分。最终鉴定出72个化合物,包括31个黄酮、15个萜类、4个蒽醌类、9个苯乙醇苷类、4个二苯乙烯类、1个决明松类、1个生物碱、2个有机酸、1个糖类和4个其他类。以上化合物分别来源于处方中的淫羊藿(32个)、黄芪(10个)、虎杖(10个)、巴戟天(1个)、地黄(17个)、枇杷叶(3个)、旋覆花(3个),川芎中未检出。2.芪仙清鸣颗粒化学成分定量分析首次建立芪仙清鸣颗粒的HPLC分析方法,依据对照品和液质联用(LC-MS)色谱中确定的化合物的紫外吸收及保留时间,在芪仙清鸣颗粒的HPLC图谱中共指认出29个化合物,包括2个有机酸类、7个苯乙醇苷类、2个二苯乙烯类、4个蒽醌类、14个黄酮类化合物。采用紫外-可见分光光度法测定芪仙清鸣颗粒中糖和蛋白质含量,分别为70~90%、2~4%。最终明确了芪仙清鸣颗粒中80%物质组成。3.芪仙清鸣颗粒体内移行成分及其作用机制分析采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS和UNIFI软件分析芪仙清鸣颗粒在大鼠血清和尿液中的移行成分。在大鼠血清中鉴定出13个原形成分和30个代谢产物,大鼠尿液中鉴定出22个原形成分和21个代谢产物。代谢产物存在多对同分异构体,表明体内代谢位点存在多样性。代谢反应主要包括羟基化、去甲基化、甲基化、甲酸化、加氢、去葡萄糖反应、葡萄糖醛酸化反应、硫酸化反应。通过多个数据库联合使用,并结合Cytoscape软件的插件,对复方中入血成分和哮喘作用靶点进行整合,得到入血成分的靶点-靶点关联(PPI)图与哮喘作用靶点的PPI图的交集,并通过设置参数筛选出核心靶点。对得到的核心靶点进行代谢通路注释,建立了“疾病-化合物-代谢通路”关联网络图,结果表明芪仙清鸣颗粒可能是通过MAPK信号通路、Wnt信号通路、Cell adhesion molecules、Toll-like receptor信号通路、T cell receptor信号通路等14条代谢通路发挥抗哮喘作用。提示芪仙清鸣颗粒通过多成分、多靶点、多途径发挥协同作用,从而达到治疗哮喘的目的。4.芪仙清鸣颗粒质量标准的研究基于前面的研究结果,选择复方中既是活性成分又是特征性成分的淫羊藿苷和虎杖苷2个化合物进行定量分析,建立HPLC法同时测定芪仙清鸣颗粒中淫羊藿苷和虎杖苷的含量。采用TLC法定性鉴别芪仙清鸣颗粒中的黄芪,黄芪甲苷斑点清新,阴性无干扰;HPLC法定性鉴别巴戟天,耐斯糖色谱峰分离度良好,阴性对照无干扰。以上方法准确,稳定可行,可用于芪仙清鸣颗粒的质量控制。综上所述,本研究采用UPLC-ESI-Q-TOF-MS对芪仙清鸣颗粒进行了化学成分表征、在大鼠血液及尿液中的移行成分分析。通过HPLC法和紫外-可见分光光度法测定芪仙清鸣颗粒中各类成分的含量,明确了芪仙清鸣颗粒中80%的物质组成。应用网络药理学方法,分析了芪仙清鸣颗粒的体内代谢通路,初步阐明其抗哮喘的作用机制,为临床应用提供给了科学依据。在此基础上,建立芪仙清鸣颗粒的质量标准。
【图文】：

色谱图,基峰,色谱图,颗粒

B 正离子模式色谱图图 2-1 芪仙清鸣颗粒基峰色谱图Fig 2-1 Base peak chromatogram of Qixianqingming granule2.3.2.1 蒽醌类化合物鉴定蒽醌类化合物的裂解规律为：在负离子模式下逐级丢失 CO 或 CO2中性碎片，留存其共轭体系；侧链取代基（羟基、甲基、羧基、羟甲基等）容易以 CO2、O、C2H2O、CH4等中性小分子（或原子）形式离去[33]。鉴定出的 4 个蒽醌类化合物均来自虎杖。通过将保留时间、分子量、碎片离子与对照品进行对比，化合物 69 鉴定为大黄素。化合物 33 和 43 均生成 m/z 431 的准分子离子峰，在 MSE图谱中，，峰 m/z 269为基峰，预示丢失一分子六碳糖（162Da）。观察到的碎片 m/z241 及 m/z225 为大黄素的典型碎片，由于虎杖中蒽醌类化合物六碳糖取代多为葡萄糖，因此推测化合物 33 和 43 为葡萄糖取代的大黄素的一对同分异构体。两个化合物的保留时间提

质谱图,化合物,倍半萜,枇杷叶

图 2-2 化合物 33 的质谱图Fig 2-2 Mass spectrum of compound 33 38 的碎片离子 m/z 431、269、225 与大黄素-O-葡萄糖苷的离子峰 m/z 511 比峰 m/z 431 质荷比多 80Da，我们推测化合物萄糖苷硫酸苷，与文献报道相符[35]。类化合物鉴定鸣颗粒中共发现 15 个萜类化合物，包括 1 个倍半萜苷类化类化合物，5 个环烯醚萜苷类化合物及 1 个倍半萜内酯。倍半萜苷类化合物鉴定鸣颗粒中鉴定出 1 个倍半萜苷类化合物且来自枇杷叶。倍半叶的主要活性成分，在正常组和四氧嘧啶引起的糖尿病模型小的作用[36]。枇杷叶中以橙花叔醇为苷元的倍半萜苷类化合物
【学位授予单位】：中国医药工业研究总院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R286

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