中药注射剂致类过敏反应中肥大细胞脱颗粒及补体活化相关机制研究

发布时间：2020-05-28 23:24

【摘要】：1研究目的与意义研究目的:本课题重点在于探讨中药注射剂(TCMI)致类过敏反应中肥大细胞脱颗粒反应及补体活化相关机制。通过前期实验基础再结合文献分析,使用易引起类过敏反应的TCMI,采用小鼠腹腔肥大细胞和小鼠类过敏反应动物模型,验证TCMI所致类过敏反应是否与补体系统的活化有关,即类过敏反应补体活化相关机制(CARPA)学说。研究意义:希望通过本课题的深入研究可以为类过敏反应体内致敏机制的明确提供新的实验依据,为TCMI致类过敏反应的临床前评价提供基础。2研究内容2.1中药注射剂致肥大细胞脱颗粒的体外实验在前期实验基础上,提取纯化小鼠腹腔肥大细胞(MC),并采用甲苯胺蓝染色确定,同时进行MC生长特性研究,以此MC作为细胞模型后,对中药注射剂(TCMI)血栓通、香丹、生脉、黄芪、参麦和双黄连六种药物进行靶细胞脱颗粒反应实验,通过测定各药物的IC50,再检测致敏靶细胞组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶三种介质释放情况,以及计算MC脱颗粒率,为下一步的体内类过敏反应机制实验确定敏感的TCMI。2.2中药注射剂致类过敏反应的补体活化相关机制研究在体外确定可导致靶细胞脱颗粒的中药注射剂(TCMI)基础上,初次注射药物后30分钟内观察小鼠是否有与类过敏反应相关的行为变化以及小鼠腹部皮肤黏膜是否出现蓝斑,并测定TCMI在体内致肥大细胞(MC)释放生物活性介质(组胺、β-氨基己糖苷酶)的情况;随后观察补体系统成分的活化,包括小鼠血清溶血现象观察、CH50测定及补体结合实验,以此确定初次致敏的小鼠模型体内是否有补体活化的存在,同时与再次致敏小鼠模型的血清补体溶血反应进行比较;最后采用免疫荧光法和流式细胞术测定MC表面C3aR的变化,以验证补体活化片段是否通过与MC表面C3aR结合而致脱颗粒反应,通过以上实验探讨TCMI致类过敏反应的补体活化相关机制研究。3研究结果3.1中药注射剂致肥大细胞脱颗粒的体外实验3.1.1小鼠腹腔肥大细胞分离、染色和生长特性研究采用Percoll提取、分离得到小鼠腹腔肥大细胞(MC),活性95%,纯度90%。通过生长曲线实验,确定MC培养24h内细胞生长稳定,可选择药物处理的时间为24h内。3.1.2中药注射剂体外致肥大细胞脱颗粒实验选择血栓通、香丹、生脉、黄芪、参麦和双黄连六种注射液,测定对肥大细胞(MC)的 IC50 分别为 1.559μl/ml、42.799μl/ml、5.371μl/ml、42.200μl/ml、36.573μl/ml和8.431μl/ml。在IC50浓度下测定体外中药注射剂(TCMI)致MC脱颗粒率、释放组胺、β-氨基己糖苷酶和类胰蛋白酶的释放率,有统计学意义的为双黄连和香丹注射液,其中双黄连注射液致敏作用比香丹注射液强,致MC释放组胺、β-氨基己糖苷酶的百分率分别为37.61%、32.71%,与阴性组相比P0.01,释放类胰蛋白酶的百分率为17.71%,与阴性组相比P0.05。MC脱颗粒百分率在0.5h开始增高,2h后逐渐下降。3.2中药注射剂致类过敏反应的补体活化相关机制研究3.2.1模型小鼠行为、黏膜蓝斑观察及肥大细胞脱颗粒测定建立类过敏反应小鼠模型,分为四组:双黄连(SHL)组、香丹(XD)组、C48/80组、生理盐水(NS)组;对小鼠首次注射药物0.5h内观察,SHL组小鼠活动减少,但达不到小鼠行为异常的评价标准;SHL组和XD组均有3只以上小鼠腹部皮肤黏膜出现蓝斑;中药注射剂体内致肥大细胞脱颗粒释放的组胺和β-氨基己糖苷酶释放率检测结果显示,SHL组为35.90%、32.71%;XD组为25.97%、24.09%,与阴性对照组相比具有统计学意义,二者相比SHL组生物活性介质释放率较高。3.2.2补体活化测定结果补体溶血反应实验结果为:双黄连(SHL)组和香丹(XD)组上清OD值分别为0.253±0.020和0.241 ±0.026,与阴性组相比P0.01,具有统计学意义;SHL组血清总补体活性测定(CH50)为78U/mL;SHL组和XD组的补体结合实验结果为阴性,但再次验证了 SHL组和XD组小鼠血清中存在活化补体成分。3.2.3初次致敏与再次致敏模型小鼠的补体溶血反应比较选择双黄连(SHL)组进行再致敏,初次致敏和再次致敏模型小鼠的行为观察和腹部皮肤黏膜蓝斑观察结果并没有明显的差异性;两组小鼠血清补体溶血反应结果为:初次致敏组上清测定OD值为0.196±0.029;再次致敏组上清测定OD值为0.182±0.018,两组与相应的阴性对照组相比P0.01,具有统计学意义,但初次致敏和再次致敏两组之间没有显著性差异。3.2.4肥大细胞表面C3aR检测肥大细胞(MC)表面C3aR免疫荧光法检测结果显示,各实验组MC表面均存在荧光,双黄连(SHL)组和香丹(XD)组荧光强度均比NS组强。MC表面C3aR流式细胞术检测结果显示,SHL组MC荧光表达百分率分别为27.60%,是NS组的5.41倍;XD组为6.60%,是NS组的1.29倍。4结论(1)通过在经过染色确认、活性测定的肥大细胞模型上进行脱颗粒活性物质检测和肥大细胞脱颗粒百分率的测定,确认了双黄连注射液和香丹注射液在体外可致肥大细胞脱颗粒。(2)通过建立小鼠动物模型,在体内测定中药注射剂同样可致肥大细胞产生脱颗粒现象,再次验证了双黄连注射液和香丹注射液可引起类过敏反应。(3)通过中药注射剂所致初次致敏小鼠动物模型的补体生物学活性测定,确定了双黄连注射液和香丹注射液可引起体内补体系统的溶血活性增高,验证了类过敏反应补体活化相关(CARPA)机制的存在。通过初次致敏与再次致敏比较,认为中药注射剂引发的初次致敏和再次致敏小鼠血清均存在补体活化,二者相比没有显著性差异。(4)通过进一步测定肥大细胞表面C3aR变化,结果说明了中药注射剂致靶细胞的脱颗粒反应中,补体活化片段可与肥大细胞上的C3aR结合,导致肥大细胞的脱颗粒反应,进一步说明中药注射剂所致类过敏反应与CARPA机制密切相关。
【图文】：

肥大细胞,甲苯胺蓝染色,细胞

正常的ＭＣ呈圆形或卵圆形，表面光滑，，细胞轮廓清晰，孔中细胞均匀逡逑分布。用Ｐｅｒｃｏｌｌ分离得到的单只昆明小鼠的ＭＣ总数为１Ｘ１０６个左右，细胞活逡逑力＞９５％，能够满足后续实验要求，结果见图１－１。逡逑＿逡逑图１－１小鼠腹腔肥大细胞（Ｘ１００）逡逑Ｆｉｇ邋１－１邋Ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ邋ｍａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ邋ｉｎ邋ｍｉｃｅ逡逑３．邋２肥大细胞甲苯胺蓝染色逡逑提取的小鼠腹腔肥大细胞（ＭＣ）经过甲苯胺蓝染色，在光学显微镜下观察逡逑细胞形态及染色性的情况。在放大１０００倍的油镜下可观察到正常ＭＣ被染成蓝逡逑色，染色均匀，细胞轮廓清楚，但正常细胞观察不到明显的细胞内颗粒，ＭＣ纯逡逑度＞９０％，结果如图１－２。逡逑２５逡逑

生长曲线,肥大细胞,生长曲线

逦＾逦＾邋＊邋＇逡逑？邋？邋？邋＊邋？逡逑图１－２肥大细胞甲苯胺蓝染色结果（Ｘ邋１０００）逡逑Ｆｉｇ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔｓ邋ｏｆ邋ｍａｓｔ邋ｃｅＨｓ邋ｕｓｉｎｇ邋ｔｏｌｕｉｄｉｎｅ邋ｂｌｕｅ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ逡逑３．邋３肥大细胞生长曲线测定逡逑对数生长期细胞新陈代谢活跃，对外界敏感性较强，是进行药理实验的良好逡逑对象。为了寻找出进行药物实验的较佳时间要进行肥大细胞（ＭＣ）生长曲线的逡逑测定。在实验中设定六个时间检测点对ＭＣ进行生长测定，ＭＣ接种浓度为ＩＸ逡逑１０５个／ｍｌ。观察ＭＣ培养２４ｈ内生长稳定，而２４ｈ后生长开始下降，此后呈衰退逡逑趋势，结果见图１－３。逡逑０．７邋－逡逑。…逡逑０．３邋－逡逑0２－逡逑０．１邋－逡逑０．０逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逦Ｉ逡逑Ｏｈ逦１２ｈ逦２４ｈ逦３６邋ｈ逦４８ｈ逦６０ｈ逡逑Ｔｉｍｅ逡逑图１＿３肥大细胞生长曲线逡逑Ｆｉｇ邋１－３邋Ｇｒｏｗｔｈ邋ｃｕｒｖｅ邋ｏｆ邋ｍａｓｔ邋ｃｅｌｌｓ逡逑３．邋４中药注射剂对肥大细胞半数抑制浓度（ＩＣ５。）测定逡逑经测定各组中药注射剂（ＴＣＭＩ）对肥大细胞（ＭＣ）的半数抑制浓度（ＩＣ５０）逡逑为：血栓通（ＸＳＴ）组为邋１．５５９ｊｉｌ／ｍｌ；香丹（ＸＤ）组为邋４２．７９９卩邋１／ｍｌ；生脉（ＳｈｅｎｇＭ）逡逑组为邋５．３７１ｐｌ／ｍｌ；黄芪（ＨＱ）组为邋４２．２０0ｎｌ／ｍｌ；参麦（ＳｈｅｎＭ）组为邋３６．５７３ｎｌ／ｍｌ；逡逑双黄连（ＳＨＬ）组为８．４３１ｎｌ／ｍｌ。由结果可见ＸＳＴ、ＳｈｅｎｇＭ和ＳＨＬ三组逡逑ＩＣ５０＜ｌ0ｎｌ／ｍｌ
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R285.5

【参考文献】