响应面优化提取柞蚕蛹多糖及其对SMMC-7721肝癌细胞的作用研究

发布时间：2020-05-29 18:14

【摘要】：目的多糖由10个以上的单糖通过糖苷键连接而成,是生物体内的大分子化合物。本文采用微波法提取柞蚕蛹中的多糖组分,响应面法优化多糖的提取条件,并将多糖进一步分离纯化作用于SMMC-7721肝癌细胞,探究其对SMMC-7721肝癌细胞的作用。方法微波法在弱碱性条件下提取柞蚕蛹多糖,在单因素实验的基础上,以多糖得率为指标,采用响应面法优化微波提取柞蚕蛹多糖的最佳工艺。Sevag(三氯甲烷:正丁醇=5:1)法除蛋白质,以H2O2脱除多糖中的色素,苯酚-硫酸法测定柞蚕蛹多糖含量。本课题用透析袋除小分子杂质。采用DEAE-52弱阴离子交换层析将多糖纯化,选用Sephadex G-150凝胶层析将对肿瘤细胞具有增殖抑制作用的PSP1活性组分进一步纯化。CCK-8法检测不同浓度的柞蚕蛹多糖提取物PSP1组分对SMMC-7721人肝癌细胞生长的抑制情况。Western blot检测Bax、Bcl-2和P53蛋白的表达。激光共聚焦免疫荧光检测P50、P65蛋白的细胞定位。结果通过响应面法优化了弱碱水提取柞蚕蛹多糖的微波提取工艺,最优提取工艺的参数分别为微波时间23 min,微波功率516 W,料液比为1:28,在最佳提取工艺条件下,多糖收率为4.72%,为灰白色粉末,测定多糖含量为71.8%。脱色的最优条件为H2O2体积分数25%,在此条件下多糖的脱色率为75.31%,多糖保留率为68.47%。DEAE-52弱阴离子交换层析法,共得到三种多糖组分,分别为PSP1、PSP2、PSP3。将三个组分分别作用于SMMC-7721细胞,结果表明PSP1多糖组分对SMMC-7721肝癌细胞具有明显的增殖抑制作用。Sephadex G-150凝胶纯化PSP1活性组分,洗脱曲线峰形基本对称,表明PSP1活性组分相对均一且纯度较高。CCK-8结果分析表明,柞蚕蛹多糖提取物对SMMC-7721细胞的增殖具有抑制作用,且呈时间和浓度依赖性,其24、48和72 h的半数抑制浓度(IC50)分别为6.606、4.114、2.569 mg/m L。Western blot检测结果表明,随着多糖提取物浓度增大,SMMC-7721细胞Bax、p53蛋白的表达逐渐升高,Bcl-2蛋白的表达逐渐降低。免疫荧光实验结果表明,多糖PSP1可能通过抑制NF-κB通路中P65/P50蛋白从细胞质移位至细胞核从而抑制肿瘤细胞的生长。结论从柞蚕蛹中提取多糖,经分离纯化后得PSP1、PSP2、PSP3,分别作用于SMMC-7721细胞,结果表明PSP1对肿瘤细胞具有明显的增殖抑制作用,并呈时间和浓度依赖性,其促凋亡机制可能为增强Bax、P53蛋白的表达,降低Bcl-2蛋白的表达。通过抑制NF-κB通路中P65/P50从细胞质移位至细胞核从而抑制肿瘤细胞的生长。实验初步证实多糖PSP1对肿瘤细胞的增殖抑制作用,为今后抗癌药物的研制及癌症的辅助治疗提供一定的基础。
【学位授予单位】：锦州医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R284;R285

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本文编号：2687302