菲牛蛭多肽成分的分离纯化及性质研究

发布时间：2020-06-01 12:51

【摘要】：本实验采用菲牛蛭作原材料,对其含有的抗凝血物质进行分离纯化,得到抗凝血活性多肽。首先对菲牛蛭粉末的基本成分进行测定,包括水分、灰分、蛋白和脂肪的含量。测定结果表明:菲牛蛭为一种高蛋白原料,蛋白含量可达68.1±0.10%,其它成分含量均较低。采用pH沉淀法、丙酮提取法、水提醇沉法、碱性蛋白酶酶解法、硫酸铵沉淀法五种方法对菲牛蛭蛋白进行粗提。碱性蛋白酶提取得到的菲牛蛭多肽的抗凝血活性最高,为 35.47±0.55U/g。为优化碱性蛋白酶提取工艺,研究了加酶量(U/g)、时间(min)、料液比和pH对碱性蛋白酶提取效果的作用,通过正交实验确定最佳工艺条件为:加酶量为2000 U/g,酶解时间为250 min,料液比为1:15,pH为9,可得抗凝血活性为72.3 U/g,水解度为 31.6%。得到高抗凝血物质的同时,另对抗凝血物质进行了抗氧化活性的测定,包括羟基自由基的清除、还原能力的测定、超氧阴离子的清除。测定结果表明:菲牛蛭酶解的抗凝血活性多肽表现出来一定的羟基自由基清除能力、一定的还原力和明显的超氧阴离子清除能力。为了进一步对提取物质进行分离纯化,本实验使用阴离子交换层析DEAE Sephadex A-50 和凝胶过滤层析 Sephadex G-50 进行分离。DEAE Sephadex A-50 得到三个组分的干燥产品,结果表明主峰HA为活性峰,活性为202.5±2.15 U/g。用Sephadex G-50凝胶过滤层析进行进一步纯化,得到具有更高活性的HA2(358.96±1.56U/g)。收集洗脱峰,进行冷冻干燥。对得到的抗凝物质进行性质的分析,通过紫外光谱扫描得出,提取液在295 nm处有最大吸收峰。傅里叶红外光谱分析得出了菲牛蛭多肽在500-4000 cm-1范围内酰胺A、酰胺B、酰胺Ⅰ、酰胺Ⅱ的红外图谱。对抗凝血活性多肽的含量进行测定结果表明,在抗凝血活性为358.96 U/mL时,多肽浓度为0.7781 mg/mL,最终得出所纯化的多肽抗凝血比活为461.33 U/mL。基质辅助激光解析飞行时间串联质谱得出活性物质为一种寡肽。对抗凝血物质的稳定性进行了测定分析表明,此抗凝血活性物质适合在中性或者弱酸性条件下,在高温下极易变性失活,应保存在低温环境中。
【图文】：

血液凝固,心脑血管疾病,药理研究,唾液腺

图１－１菲牛蛭逡逑Ｆｉｇ．邋１－１邋Ｉ邋ｌｉｒｕｄｉｎａｒｉａ邋ｍａｎｉｌｌｅｎｓｉｓ逡逑学成分逡逑动物，含有１７－１９种氨基酸成分，八种人的作用。菲牛蛭中还含有微量元素和脂肪。另外，菲牛蛭中还含有丰富的脂肪酸，心脑血管疾病等功能。菲牛蛭中提取的脂的研究和开发也具有重大的价值［Ｗ｜。苗艳丽种为人体需耍的常量元素，四种是人体必素Ｃａ的含量均较高含量达到了邋１４．１１邋ｍｇ／ｇ。１．３７ｍｇ／ｇ，１．３３ｍｇ／ｇ［７＼根据药理研究发微量元素Ｆｅ、Ｍｇ、Ｚｎ有关。逡逑物质主要来源于头部唾液腺和分泌的唾液［４的是防止血液凝固，易于吸血。菲牛蛭中。

凝血酶,滴定,现象,丙酮

图２－１凝血酶滴定现象逡逑ｇ．２－１邋Ｐｈｅｎｏｍｅｎｏｎ邋ｏｆ邋ｃｌｏｔｔｉｎｇ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｔｅ，加入４０邋ｍＬ邋０．９％的ＮａＣＨ容液（的三氯醋酸溶液调ｐＨ至２．５，ｎ离心１５邋ｍｉｎ，弃沉淀，收集上离心１５ｍｉｎ，上清液即粗提液，，加入４０邋ｍＬ含水１５％的冷丙酮丙酮溶液和菲牛蛭千粉的混合物４邋°Ｃ，邋８０００邋ｒ／ｍｉｎ下离心１５邋ｍｉｎ，Ｌ三氯乙酸溶液溶，４邋°Ｃ，８０００邋ｌｍｏｌ／Ｌ调ｐＨ到７．０，，测定菲，加入４０邋ｎｉＬ蒸馏水，磁力搅拌
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R284.2

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