中药决明子和钩藤的质量控制研究

发布时间：2020-06-02 16:58

【摘要】：目的:中药决明子,为豆科植物决明Cassia obtusifolia L.或小决明Cassia tora L.的干燥、成熟的种子。具有名目、保肝、通便等功效。现代药理学研究发现,决明子具有降血压、降血脂、抗衰老、抗氧化以及免疫和抗肿瘤等作用。其在全国各地及海外均有广泛种植,但是由于各地栽培环境的不同,加工运输等差异,导致了该药材的质量存在一定的差异。《中国药典》(2015年版)规定将其中所含的蒽醌类成分橙黄决明素和大黄酚的含量测定作为决明子药材的质量控制的标准。但是由于其药理作用广泛,主要的药效成分较多,仅凭两个成分的含量测定作为其质量控制的指标不能完全反应其质量。因此需要对其质量控制的标准继续进行补充和完善。本实验建立决明子超高效液相色谱指纹图谱、五种蒽醌类成分的含量测定方法并结合液质联用技术来对决明子中所含的化学成分进行分析,对现有的决明子质量标准进行补充,并采用斑马鱼的高脂血症模型,以斑马鱼尾部血脂染色强度作为定量指标,初步评价不同批次间决明子药材的药理活性,为中药质量控制体系进行补充和完善。中药钩藤,为茜草科植物钩藤Uncariarhynchophylla(Miq.)Miq.ex Havil、大叶钩藤Uncariamacrophylla Wall、毛钩藤Uncariahirsute Havil、华钩藤Uncariasinensis(Oliv)Havil.或无柄果钩藤Uncaria sessilifiuctus Roxb.的干燥带钩茎枝。目前,市场上的钩藤药材品种较为复杂,而不同品种间的钩藤药材的化学成分、药理作用也存在差异。《中国药典》(2015年版)尚未收载钩藤含量测定的标准,只有定性鉴别,严重影响钩藤药材的质量控制及其应用。本实验通过收集钩藤品种和大叶钩藤品种的钩藤药材,在同一色谱条件下建立其UPLC指纹图谱,并测定大叶钩藤中具有显著药理活性的钩藤碱与异钩藤碱的含量,为完善钩藤和大叶钩藤两个品种药材的区分和质量控制提供参考。方法:(1)收集28批不同产地的决明子药材,采用UPLC法结合聚类分析、主成分分析以及相似度评价三种分析方法建立了中药决明子的指纹图谱。(2)采用UPLC法同时测定28批决明子药材中大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、橙黄决明素、黄决明素五种蒽醌类成分含量,为其现有的质量标准的完善提供参考。(3)采用LC-MS对决明子药材中所含的化学成分进行分析,为决明子药材的质量控制以及药效物质基础研究提供参考。(4)采用斑马鱼的高脂血症模型,将斑马鱼尾部血脂染色强度作为实验的定量分析指标,初步评价不同批次决明子药材的药理活性,为其质量控制的补充提供参考。(5)收集不同产地的12批钩藤药材和10批大叶钩藤药材,采用UPLC法建立钩藤和大叶钩藤的指纹图谱,为上述两个品种钩藤药材的区分和质量控制提供参考。(6)采用UPLC法测定10批大叶钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的含量,为大叶钩藤的质量控制进行补充。(7)根据上述实验所得结果,初步制定决明子和钩藤药材的质量标准增订草案。结果:(1)运用UPLC的方法,建立28批不同产地间的决明子药材的UPLC指纹图谱,共计匹配出40个共有峰,通过与标准品的比对,指认出10种成分,28批药材的相似度较高,其相似度的范围在0.827～0.990之间,总体来看,中药决明子的质量是较为稳定的。通过聚类分析、主成分分析得出中药决明子虽广泛种植于全国各地,但是海南与山东所产的品质较好,可能与当地的气候条件相关。(2)采用UPLC的方法,对决明子药材中的五种蒽醌类成分大黄素、大黄酚、橙黄决明素、黄决明素、大黄素甲醚进行了含量测定,结果表明,橙黄决明素和大黄酚的含量均符合药典规定,黄决明素含量在0.1809～1.1311 mg·g-1,大黄素含量在0.1952～0.8940 mg·g-1,大黄素甲醚含量在0.1917～0.8752mg·g-1。并进行方法学考察,表明本实验所用仪器精密度良好,样品的稳定性和重复性以及加样回收率均可符合药典规定的标准,为《中国药典》质量标准的进一步完善提供参考。(3)采用液质联用技术来推测决明子中所含有的化学成分,在正离子和负离子模式下,对实验所得的数据进行分析,并推断出39个决明子中可能含有的化合物。结果表明,决明子中所含的蒽醌类成分以游离型蒽醌和结合型蒽醌苷类的形式存在,蒽醌苷类成分由于其与糖连接的位置以及糖基种类的不同而呈现出多样化。同时,萘并吡喃酮类化合物在决明子中大量存在,种类繁多,其药理活性有待进一步的开发和利用。本方法可以快速的推断决明子药材中所含有的化学成分。同时,也可为决明子药材的质量控制提供一定的参考。(4)采用斑马鱼的高脂血症模型来验证决明子药材对于高脂血症的防治作用,并对不同批次药材的活性进行分析,结果表明,在实验浓度范围内,决明子药材的药理活性随着给药浓度的增大而增强,不同批次的决明子药材总提物均能对斑马鱼幼鱼的脂肪吸收产生不同程度的抑制作用。其中指纹图谱中相似度较低的药材S27在药效作用的发挥上弱于S25和S26,相似度评价较高的药材在药效作用的发挥上更加明显。(5)在同一色谱条件下建立12批钩藤品种药材和10批大叶钩藤品种药材的UPLC指纹图谱。经相似度评价软件进行分析,12批钩藤品种药材的UPLC指纹图谱共计匹配出22个共有峰,12批钩藤品种药材中,11批的相似度均大于0.9,仅一批低于0.9,为0.737,10批大叶钩藤共匹配出12个共有峰,其相似度均在0.9以上。而通过对比钩藤和大叶钩藤的两个品种的对照指纹图谱,发现其所含化学成分差异较大、而其中有效成分钩藤碱、异钩藤碱的含量亦有较大差异。大叶钩藤中钩藤碱和异钩藤碱的含量较高,因此,本实验所建立的方法可以用于对钩藤和大叶钩藤两个不同品种间的药材进行区分,同时也可用于两个品种的质量控制。(6)运用UPLC的方法,测定大叶钩藤药材中的钩藤碱和异钩藤碱的含量,其中,钩藤碱的含量范围在0.2214～0.6469 mg·g-1,而异钩藤碱的含量范围在0.0424～0.1309 mg·g-1。二者总和的含量范围在0.2657～0.7559 mg·g-1。通过对其进行方法学考察,表明本实验精密度、稳定性、重复性以及加样回收率实验均可达到《中国药典》所规定的相关标准,因此,本方法结合前期指纹图谱的相关实验,可为大叶钩藤药材的质量控制提供参考。(7)以上述实验结果为依据,对中药决明在现有质量标准的基础上增加指纹图谱和3个成分的含量测定项;对大叶钩藤增加指纹图谱和2个成分的含量测定项;对钩藤增加指纹图谱,初步制定中药决明子和钩藤的质量标准增订草案。结论:运用UPLC建立中药决明子的指纹图谱并对其中的五种蒽醌类化学成分进行了含量测定,同时结合LC-MS技术对决明子中的所含的化学成分进行分析,有利于决明子的进一步开发和利用,实验验证斑马鱼的高脂血症模型,并初步评价不同批次间的决明子药材的药理活性,为中药决明子质量标准的完善提供了新的思路和方法。本文建立钩藤药材中钩藤和大叶钩藤的UPLC指纹图谱,并对大叶钩藤中的钩藤碱和异钩藤碱进行了含量测定,为这两个品种的钩藤药材的区分和质量控制的完善提供参考。
【图文】：

决明子,色谱峰

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决明子,龙胆二糖,链霉素,色谱图

模式图的生成方式，运用多点校正的方法手动调节了第１４号共有峰，并对２８批样品的逡逑色谱峰进行了全谱峰的匹配，建立了中药决明子指纹图谱共有模式，得到４０个共有峰，逡逑结果见图２－１、图２－２。逡逑通过与对照品进行比对，初步可以确认样品中的１０个化合物，分别为决明子苷Ｂ２，逡逑决明子苷（：２，红链霉素－６－０－Ｐ－龙胆二糖苷，决明子苷Ｃ，橙黄决明素，大黄酸，黄决明逡逑素，，大黄素，大黄酚，大黄素甲醚，结果见图２－３。逡逑４４逡逑
【学位授予单位】：北京中医药大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R284.1

【参考文献】